style="width:3.09333in" />GB/T 34777—2017 本文是学习GB-T 34777-2017 中国仓鼠卵巢 CHO 细胞表达产品残留DNA检测 荧光定量PCR法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了检测残留宿主DNA 的荧光定量 PCR 法。
本标准适用于CHO
(中国仓鼠卵巢细胞)宿主细胞系表达的生物制品的残留宿主DNA 的检测。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
Ct 值 cycle threshold
每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。
下列缩略语适用于本文件。
CHO: 中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)
以真核细胞基因组中具有高拷贝数的16SrRNA
为目的基因，设计特异性扩增该基因的 PCR 引
物，包括正向引物：Forward Primer(5'-CCAGGCATTGGTGGCAC-3')和反向引物：
Reverse Primer
(5'-AGACAGGGTTTCTCTGT-3')。
采用SYBR 荧光定量 PCR(FQ-PCR) 法，采集荧光绘制出的PCR 扩增曲线Ct
值，与扩增体系中起 始目的基因模板的对数值呈反比，以起始模板 DNA
对数值为纵坐标，Ct 值为横坐标，制作标准曲线。
根据标准曲线方程计算样品的DNA 残留量，从而达到定量检测样品残留 DNA
的含量目的。
6.1 荧光定量 PCR 仪：含有SYBR 荧光染料检测通道。
6.2 紫外-可见分光光度计：波长范围：200 nm～760 nm。
6.3 微型离心机：转速范围：2000 r/min～23000 r/min。
GB/T 34777—2017
6.4 电热恒温水浴锅：室温至100℃;温度波动范围：士0.5℃;温度显示精度：0.1℃。
除非另有说明，本方法中仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682
规定的一级水。试剂盒的组成与相
关试剂的配制方式参见相应的厂家说明书。
7.4 引物：PCR 正向引物：Forward Primer(5'-CCAGGCATTGGTGGCAC-3'合成
PAGE 级); PCR 反向引物：Reverse Primer(5'-AGACAGGGTTTCTCTGT-3'合成
PAGE 级)。
7.8 蛋白酶 K(Proteinase K)。
8.1.1 待测样品残留 DNA 的提取制备
用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1 mg/mL～20 mg/mL,取100μL
稀释后的样品，参照
DNA 提取试剂盒的说明书，进行残留 DNA 的提取。
8.1.2 阳性对照样品 DNA 的提取制备
用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1 mg/mL～20 mg/mL,取100 μL
稀释后的样品，加入20 μL
100 pg/mL 的 DNA 标准品，参照 DNA 提取试剂盒的说明书，进行残留 DNA
的提取。
8.1.3 阴性对照样品 DNA 的提取制备
用待测样品所对应的制剂缓冲液作为样品，参照8.1.1的方法进行相同倍数的稀释后，取100
μL 稀
释后的样品，参照DNA 提取试剂盒的说明书，进行残留DNA 的提取。
取 DNA 标准品，分别稀释至100 ng/mL、10 ng/mL、1ng/mL、100 pg/mL、10
pg/mL、1 pg/mL和
0.1 pg/mL等系列浓度，用于标准曲线的制备。
8.2.2 Real-time PCR 条件及体系
按表1进行反应体系的配制，各样品制备3个复孔，加样过程先将除 DNA
模板(即供测试的样品)
以外的各组分预混合，16μL/孔，最后加入标准品/待测样品/阴性对照/阳性对照
DNA 9μL/孔，加好
GB/T 34777—2017
后盖紧盖子，将PCR96
孔板或8联管于台式离心机中瞬时离心，使混合液集中于底部。放入 PCR 仪
的抽屉。
表 1 PCR 扩增体系
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1.6 μL |
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将制备好的PCR 反应体系放入 PCR 仪的抽屉，按表2的反应条件进行PCR 扩增。
表 2 PCR 扩增条件
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| 95 ℃ | 95 ℃ |
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72 ℃ |
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60 ℃ | 95 ℃ | 60 ℃ |
| 30 s | 1 min | 1 min | 1 min | 15 s | 1 min | 30 s | 15 s |
8.2.4.1
有效扩增孔的取舍：根据如下检测数值的取舍标准选择有效孔：
a)
标准曲线上各数据点复孔，可根据标准曲线线性关系的好坏来判断是否舍去，可舍去明显影响
标准曲线相关性(使R²≥0.99)
的复孔数据。整条曲线上舍去的复孔数不得超过3个；
b) 阳性对照、待测样品各复孔间检测的Ct 值的SD
值大于0.5时，且由此计算的 DNA 残留值在
定量限以上，则该数据应重新检测。
8.2.4.2 系统适用性要求：
a) 扩增效率应在90%～110%;
b) 标准曲线的相关系数R²≥0.99;
c) 阳性对照样品中DNA 标准品的加样回收率应在50%～150%;
d) 阴性对照孔无非特异性扩增(DNA 含量应小于或等于1 pg/mL)。
阳性对照中 DNA 标准品的加样回收率为实际检测到在阳性对照中添加的 DNA
标准品的量，除以 在阳性对照中添加的 DNA
标准品的理论值。阳性对照中检测到的 DNA 总量减去待测样品中检测得
到的DNA 量即为实际检测到添加的 DNA 标准品的量。由于各样品中提取的 DNA
体积固定，在计算
过程中直接用浓度表示。
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8.3.2 阳性对照样品中的 DNA 标准品加样回收率
阳性对照样品中的 DNA 标准品加样回收率按式(1)计算：
style="width:2.50003in;height:0.60016in" /> (1)
式中：
R— DNA 标准品加样回收率，%;
p₁- 阳性对照品中的 DNA 浓度测定值，单位为皮克每毫升(pg/mL);
p2— 待测样品中DNA 浓度测定值，单位为皮克每毫升(pg/mL);
p₃—— 加入的对照品 DNA 的终浓度，为20 pg/mL。
8.3.3 待测样品残留 DNA 含量
待测样品残留 DNA 含量按式(2)计算：
式中：
style="width:1.37997in;height:0.6732in" />
……………………………
(2)
x— 待测样品残留DNA 含量，单位为皮克每毫克(pg/mg);
p4- 待测样品中 DNA 浓度，单位为皮克每毫升(pg/mL);
f— 稀释倍数；
ps— 待测样品蛋白浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)。
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