ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2725—2022 规模化牛场细菌性腹泻防控技术规范 Technical specification for bacterial diarrhea prevention and control in large-scale cattle farms 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2725—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、金宇保灵生物药品有限 公司、内蒙古伊利实业集团股份有限公司、北京生泰尔科技股份有限公司。 本文件主要起草人：徐晓静、王建龙、谢梦圆、王秀敏、魏小军、赵晓军、吴晓亮、张志丹、陈坚、 韩四娥、黄海碧、王旭红、秀英、杜鹏。 I DB15/T 2725—2022 规模化牛场细菌性腹泻防控技术规程 1 范围 本文件规定了规模化牛场细菌性腹泻的诊断和防治。 本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物诊疗机构对致病性大肠杆菌、沙门菌、 副结核分枝杆菌引起牛腹泻疾病的防控。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T 16568 奶牛场卫生规范 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 27637 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 NY 5047 无公害食品 奶牛饲养兽医防疫准则 NY/T 5049 无公害食品 奶牛饲养管理准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 细菌性腹泻 （bacterial diarrhea） 由细菌性病原引起，以腹泻为主要症状的常见肠道传染病。犊牛大肠杆菌性腹泻又称为犊白痢，沙 门菌病又称为犊牛副伤寒，副结核分枝杆菌引起的腹泻又称为副结核性肠炎。 4 生物安全措施 样品处理的生物安全措施符合GB 19489的规定。 样品采集的生物安全措施符合GB/T 27401的规定。 5 病原 致病性大肠杆菌 1 DB15/T 2725—2022 革兰染色阴性杆菌，大小为0.4 µm～0.7 µm×2 µm～3 µm，两端钝圆。 沙门菌 革兰染色阴性杆菌，大小为0.7 µm～1.5 µm×2 µm～5 µm。 副结核分枝杆菌 革兰染色阳性短杆菌，大小为0.2 µm～0.5 µm×0.5 µm～1.5 µm，抗酸染色红色。 6 诊断 临床诊断 6.1.1 流行病学 不同年龄和品种牛均可感染，幼龄牛易感，犊白痢多发于 1月龄内犊牛；犊牛副伤寒多发于1～5月 龄的犊牛；副结核性肠炎多发于成年牛。病牛和带菌牛是本病自然流行的传染源，随粪便排出大量病原 菌，污染外界环境。消化道是最主要的传播途径。一年四季均可发生，尤以气候多变、寒冷季节好环境 卫生较差时多发。 6.1.2 临床症状 6.1.2.1 犊白痢 牛初期体温升高达41 ℃～42 ℃，有的犊牛出生后数小时开始腹泻。初期粪便呈粥样、白色或黄白 色，后期呈水样、灰白色，混有未消化的凝乳块、血液及泡沫，有酸臭味。末期患病牛伴有腹痛，用蹄 踢腹壁。可发生脐炎或关节炎，偶见肺炎。耐过病牛发育迟缓。有时可见神经症状，兴奋不安，有些病 例可突然死亡。 6.1.2.2 犊牛副伤寒 主要由鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌引起。 犊牛多发病突然，病初体温升高至40 ℃～41 ℃，24 h后排出灰黄色稀便，混有黏液和血丝，一般 于出现症状后5 d～7 d内死亡。病程长者可能会出现腕关节和跗关节肿大。 成年牛感染表现高热、昏迷、食欲废绝、呼吸困难，发病后12 h～24 h粪便中带有血块，随即腹泻。 粪便恶臭，含有纤维素絮片。病牛常死于高热期后。病程长者可见脱水、消瘦、眼窝下陷，黏膜充血发 黄。妊娠牛多流产。 6.1.2.3 副结核性肠炎 潜伏期较长，一般多见于2～5岁成年牛，发病初期为间歇性腹泻，逐渐变为顽固性腹泻，腹泻呈喷 射状水样便，排泄物稀薄、恶臭，带有气泡、黏液。体温常无变化，病程长者可见显著消瘦，皮下水肿。 6.1.3 病理变化 6.1.3.1 犊白痢 剖检可见皱胃和小肠黏膜充血、水肿和出血，皱胃内有大量凝乳块，黏膜表面覆盖胶状黏液。肠内 容物常混有血液和气泡，恶臭。肠系膜淋巴结肿大。经脐带感染的病例可见出血性脐炎和出血性脐动脉 炎。病程长者伴有浆液纤维素性关节炎和出血性或浆液出血性肺炎。突然死亡的病例常无明显病理变化。 2 DB15/T 2725—2022 6.1.3.2 犊牛副伤寒 剖检可见肠内容物稀薄，混有黏液和血液，呈咖啡色。病程较长时，小肠可见浮膜性与固膜性肠炎， 肠系膜淋巴结呈不同程度的水肿、出血。皱胃黏膜充血、水肿，表面被覆大量黏液，有时可见出血点。 脾脏明显肿大而柔软，呈灰红或暗红色，边缘钝圆，被膜紧张，可见出血斑点和粟粒大的坏死灶。肝脏 肿大，质地柔软，被膜下散在针尖大的灰黄或灰白色病灶。 6.1.3.3 副结核性肠炎 剖检可见尸体极度消瘦，可视黏膜因贫血呈苍白色，被毛粗乱无光。特征性病变为慢性增生性肠炎 及相应的淋巴结炎。病变多集中于空肠、回肠和结肠前段。病变肠管变粗，肠腔狭窄，黏膜覆盖一层灰 白色黏稠的糊状物。肠黏膜增厚2～30倍，折叠形成脑回样皱襞。病变部肠管的浆膜淋巴管和相应的肠 系膜淋巴管扩张、增粗，呈弯曲的细绳索状，肠系膜淋巴结肿胀。 6.1.4 结果判定 符合6.1.1、6.1.2、6.1.3，可判定为牛细菌性腹泻疑似病例。 实验室诊断 6.2.1 主要仪器设备 37 ℃恒温细菌培养箱、倒置显微镜、PCR 仪、PCR 管、电泳仪、凝胶成像仪。 6.2.2 主要试剂 生理盐水、细菌微量生化反应管及指示剂、Taq 酶、TAE 电泳缓冲液、DNA Marker。 6.2.3 样品采集 6.2.3.1 粪便样品 将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，也可无菌采集地上刚排出新鲜粪便。分别放入装有3 mL高压灭 菌的生理盐水采样管中，编号并记录相关信息。 6.2.3.2 组织样品 取病死牛肠道、肝、脾、淋巴结、胃、脐带等，置于无菌密封袋或采样杯内。 6.2.4 病原检测 6.2.4.1 细菌培养 6.2.4.1.1 大肠杆菌培养 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂上形成黑色带金属光泽的菌落；麦康凯琼脂培养基上形成红色菌落。 6.2.4.1.2 沙门菌培养 沙门菌在SS培养基上形成中心黑色的无色菌落；HE琼脂培养基上形成蓝绿色或蓝色菌落，多数菌落 中心黑色；去氧胆盐钠-枸橼酸盐培养基上形成无色透明菌落。 6.2.4.1.3 副结核分枝杆菌培养 3 DB15/T 2725—2022 副结核分枝杆菌初代分离困难，在病变肠段及肠淋巴结分离率较高，可先用4% H2SO4 或2% NaOH 处 理，Dubods培养基上形成乳白色或米黄色不透明菌落；HEYM培养基上形成乳白色、光滑、边缘整齐的菌 落。 6.2.4.2 染色镜检 6.2.4.2.1 大肠杆菌革兰染色 挑取伊红美蓝琼脂和麦康凯琼脂培养基上的大肠杆菌特征性菌落涂片，进行革兰染色，镜下可观察 到粉红色的杆菌。 6.2.4.2.2 沙门菌革兰染色 挑取SS培养基、HE琼脂培养基和去氧胆盐钠-枸橼酸盐培养基上的沙门菌特征性菌落涂片，进行革 兰染色，镜下可观察到粉红色的杆菌。 6.2.4.2.3 副结核分枝杆菌抗酸染色 挑取Dubods 培养基和HEYM培养基上的副结核分枝杆菌特征性菌落涂片，进行抗酸染色，镜下可观 察到红色成丛、两端钝圆的杆菌。 6.2.4.3 生化鉴定 根据伯杰细菌手册对细菌性病原进行生化特性鉴定。 6.2.4.3.1 大肠杆菌 挑取单个菌落纯培养后接种细菌微量生化反应管，进行甲基红试验、吲哚（靛基质）试验、枸橼酸 盐试验、V-P试验、硫化氢试验、三糖铁试验、尿素酶试验、糖类分解试验（葡萄糖、乳糖、甘露糖、 蔗糖）等。甲基红试验、吲哚试验、葡萄糖和甘露糖发酵试验结果呈阳性，枸橼酸盐试验、V-P试验、 尿素酶试验结果呈阴性，三糖铁琼脂斜面呈黄色、底层产气，几乎均不产生硫化氢，大多数菌株可迅速 发酵乳糖，仅极少数迟发酵或不发酵，约半数菌株不分解蔗糖，符合以上生化反应说明与大肠杆菌特性 相符。也可用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 6.2.4.3.2 沙门菌 挑取单个菌落纯培养后接种细菌微量生化反应管，进行甲基红试验、吲哚（靛基质）试验、枸橼酸 盐试验、V-P试验、硫化氢试验、三糖铁试验、糖类分解试验（卫矛醇、山梨醇、乳糖、棉子糖、蔗糖） 等。甲基红试验、枸橼酸盐试验、卫矛醇和山梨醇发酵试验结果呈阳性，吲哚试验、V-P试验、乳糖、 棉子糖、蔗糖分解试验结果呈阴性，在三糖铁琼脂上常产生硫化氢，符合以上生化反应说明与沙门菌特 性相符。也可用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 6.2.4.4 血清学鉴定 6.2.4.4.1 致病性大肠杆菌血清学鉴定 按照GB 4789.6对致病性大肠杆菌进行血清学鉴定及结果判定。 6.2.4.4.2 沙门菌血清学鉴定 按照GB 4789.4对沙门菌进行血清学鉴定及结果判定。 4 DB15/T 2725—2022 6.2.4.5 PCR 检测 6.2.4.5.1 DNA 提取 将采集的样品进行处理，按DNA提取试剂盒方法提取核酸。在-20 ℃条件下可短时间保存，若需长 期保存，应置于-70 ℃以下条件，避免反复冻融。 6.2.4.5.2 致病性大肠杆菌 PCR 检测 按照GB 4789.6对致病性大肠杆菌进行PCR检测及结果判定。 6.2.4.5.3 沙门菌 PCR 检测 根据沙门菌毒力基因inv A设计引物。参考李文豪论文“呼和浩特牛腹泻部分细菌性病原检测及三 重PCR检测方法的建立”中的引物序列：F：CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA；R：TAGACAGGGCGGAGGACAAATC。 25 µL反应体系配制：模板2 µL，上下游引物各1 µL，Taq 酶12.5 µL，RNase-Free H2O 8.5 µL。 反应参数：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，3