ICS 65.020.01 CCS B 31 15 内蒙古自治区 地方 标准 DB15/T 2855—2023 马铃薯腐烂茎线虫的 qPCR检测技术规程 Code of practice for qPCR detection of ditylenchus destructor 2023-01-28发布 2023-02-28实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2855 —2023 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（ SAM/TC 20 ）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、中国农业大学、鄂尔多斯市农牧技术推广中心、 内 蒙古自治区农牧业技术推广中心、鄂托克前旗农牧业技术推广中心 。 本文件主要起草人：席先梅、张力群、霍宏丽、陈伟、苗春乐、融晓君、路奇、尤俊文、张晓霞、 贺小勇、孔庆全、张冬梅、田晓燕。 DB15/T 2855 —2023 1 马铃薯腐烂茎线虫的 qPCR检测技术规程 1 范围 本文件规定了利用 qPCR检测技术对马铃薯腐烂茎线虫检测的试剂、仪器、样品处理、 DNA提取、结 果记录和样品保存等内容。 本文件适用于土壤和马铃薯植物样品中腐烂茎线 虫的qPCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和储存 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 腐烂茎线虫 ditylenchus destructor 腐烂茎线虫属于线虫门（ Nematoda ）、侧尾腺纲（ Secernrntea ）、垫刃目（ Tylenchida ）、粒科 （Anguinidae ）、茎线虫属（ Ditylenchus ），是危害马铃薯的 重要病原线虫，可引起马铃薯叶片黄化、 萎蔫、块茎干腐等症状，导致减产和品质降低。参见附录 A。 定量 PCR quantitative PCR 定量PCR技术 （quantitative PCR ，qPCR） 是指在PCR反应体系中加入可与靶标 DNA结合的荧光基团， 依据荧光信号的强度对扩增产物进行实时监测，从而实现对初始靶标 DNA模板量进行定量分析的技术。 根据荧光信号来源可分为染料法和探针法。 4 试剂和仪器 试剂 4.1.1 除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实 验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。 4.1.2 土壤提取缓冲液： 1 M Tris-HCl，0.1 M EDTA ，1.5 M NaCl ，2% CTAB，0.1 M NaH 2PO4/Na2HPO4， pH=8.0。 DB15/T 2855 —2023 2 4.1.3 CTAB缓冲液： 2% CTAB，1.4 M NaCl ，0.1 M Tris -HCl，0.02 M EDTA ，pH=8.0。E缓冲液： 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，pH=8.0。 4.1.4 TE缓冲液： 10 mM Tris -HCl，1 mM EDTA ，pH=8.0。 4.1.5 其他试剂包括 Tris饱和酚（ pH=7.8），氯仿，异丙醇，无水乙醇， 70%乙醇，20% SDS，rTaq DNA 聚合酶（ 5 U/μL）及其缓冲液， 25 mM 氯化镁（ MgCl 2）溶液， dNTPs溶液（含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各2.5 mM），0.1%牛血清蛋白（ bovine serum albumin ，BSA）。 仪器 超微量分光光度计，真空抽干仪，普通天平（感量 0.01 g），高速离心机， 4 ℃冰箱，医用冰箱（ - 20 ℃），超 低温冰箱（ -80 ℃），制冰机，水浴锅，涡旋振荡仪，磁力搅拌器，高压灭菌锅，定量荧 光PCR仪，金属浴，超净工作台， pH计，移液器（ 2 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL，1000 μ L），土壤取样器（内径小于等于 2 cm），研钵及研杵，土壤粉碎机。 材料 离心管（ 1.5 mL，2 mL，50 mL），PCR管（200 μL），吸头（ 10 μL，200 μL，1000 μL），量 筒（50 mL）。 5 样品处理及 DNA提取 土壤样品采集、前处理及 DNA提取 5.1.1 土壤样品采集 土壤样品采集方法采用 NY/T 1121.1 。取样时应使用内径 小于等于 2 cm的土壤取样器，取样深度为 15 cm～20 cm，“W”型取样 15点～20点，每份土样重量以 500 g～1000 g为宜。 5.1.2 土壤样品前处理 土壤样品采集后应及时进行干燥处理，可于室内环境自然风干，风干过程中避免阳光直晒和高温高 湿环境。此外，土壤样品也可于干燥箱中（ ≤40 ℃）进行 24 h烘干。 去除土壤样品中的石块，沙砾，塑料薄膜等成分，保留植物组织，使用土壤粉碎机破碎干燥土壤样 品。使用翻拌法对土壤样品进行混匀，即使用玻璃棒或塑料棒将土样 平铺于玻璃板或纸张上，用铲子进 行对角翻拌，重复 20次以上。混匀后的土壤样品密封后于阴凉干燥处保存。每份样品处理完毕后需对土 壤粉碎机，玻璃棒和玻璃板等仪器工具进行清洗和消毒以避免样品间交叉污染。 5.1.3 土壤样品 DNA提取 取6.2.2中经前处理的土壤样品，按照四分法进行取样，将土样平铺于塑料薄膜或纸张上，呈四方 形，根据对角线将土样分成四份，对角两份分别合并为一份，取其中一份继续进行四分法，直到获得所 需数量为止。 每份土样取 3个重复，每个重复取 10 g土样于50 mL离心管中，加入 20 mL土壤提取缓冲液，涡旋震 荡使之充分混匀， 取 1.2 mL土壤悬浮液于 2 mL离心管中， 加入 300 μL 20% SDS 溶液， 涡旋混匀后于 65 ℃ 水浴2 h，期间每 10 min颠倒混匀一次，水浴完毕后 12000 rpm 离心5 min，取600 μL上清于新的 2 mL离 心管中，加入 600 μL氯仿，震荡混匀， 12000 rpm 离心10 min，取550 μL上清于新的 2 mL离心管中， 加入550 μL Tris饱和酚，震荡混匀， 12000 rpm 离心10 min，取500 μL上清于新的 2 mL离心管中，加 入500 μL氯仿，震荡混匀， 12000 rpm 离心10 min，取500 μL上清于新的 1.5 mL离心管中，加入 350