ICS 65.020.20 Ccs B 41 江 DB32 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 4366 -2022 人载脂蛋白 AⅠ羊多抗血清制备技术规程 Technical regulations for production of sheep anti-human apolipoprotein A Ⅰ polyclonal antiserum 2022-09-06 发布 江苏省市场监督管理局 2022-10-06 实施 发布 DB32/T 4366-2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。 本文件起草单位：江苏丘陵地区镇江农业科学研究所、句容市农业农村局、江苏大学、 江苏省农科院。 本文件主要起草人：徐志伟、姚明霞、徐一然、温小林、邓碧华、于建宁、李云、胡 强、张兆丽、谭圣伟、盛媛媛。 I DB32/T 4366-2022 人载脂蛋白 AⅠ羊多抗血清制备技术规程 1 范围 本文件运用于人载脂蛋白 AⅠ羊多抗血清制备中羊品种选择和饲养要求、免疫佐剂 选用、抗原乳化、抗原接种、抗体效价评估、抗血清制备的步骤和方法。 2 规范性引用文件 本文件无规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 载脂蛋白 AⅠ Apolipoprotein AⅠ 用于运输血液中脂类的高密度主要载脂蛋白, A1是载脂蛋白A族中最多的一种组分， 约占HDL颗粒的65%，主要在肝脏、部分在小肠合成。 4 羊的选择和饲养要求 选用体重30kg—40 kg生长发育良好、10月龄左右的健康羊。采用群养放牧，适当补饲 方式，每天早晚观察羊的健康状况。 5 抗原要求 人血清通过优化PEG沉淀、离子交换吸附的方法，纯度达96%。 6 免疫佐剂选用 首次免疫佐剂采用弗氏完全佐剂，从第二次免疫开始，采用弗氏不完全佐剂。 7 抗原乳化 采用高速剪切法乳化抗原。乳化容器需放置在降温夹套中，将佐剂按需要量置于乳化 容器中，用吸管以60滴/min的速度缓慢加入载脂蛋白AⅠ抗原溶液，用漩涡混合器以1.5万 1 DB32/T 4366-2022 rmp/min混合均匀，抗原溶液全部加完后，再持续混合15min。 8 抗原接种免疫剂量和部位 每只羊免疫抗原剂量为 1mg，抗原浓度为 1mg/ml,为各部位平均接种。不同免疫次数 间的间隔天数和部位，见表 1。 表1 第1次 间隔天数 （d） 0 第2次 15 第 3~9 次 9 次数 9 免疫剂量和部位 免疫接种部位 腹股沟、肘部、耳后、额下、背侧和足窝 腹股沟、肘部、耳后、额下、背侧和腹股沟 淋巴结点 腹股沟、肘部、耳后、额下和背侧 抗体效价评估 在第 7 次免疫后动脉采血检测抗体水平，采用琼脂扩散法进行效价测定,效价不低于 1： 16，可以判定为合格，可以采血。 10 抗血清制备 10.1 采血 在检测抗体水平达到效价要求后，采用动脉一次性采血。血液用 250 mL 玻璃瓶收集， 血液占玻璃瓶的 1/5。 10.2 血清制备 把收集好血液的玻璃瓶，放在 37℃恒温水浴锅中 1h 后，把玻璃瓶从水浴锅中取出； 再把血清从玻璃瓶中吸出；用低速离心机 4500 rmp/min，离心 15 min，取上清液，颜色为 乳白色或微黄色，去掉沉淀物杂质。 10.3 外观质量 血清应呈黄色或微红色血清状液体，允许少量的絮状物或沉淀。 10.4 血清保存 2 DB32/T 4366-2022 血清用灭菌处理的塑料瓶保存。在-20℃保存 3 年，或-70℃保存 6 年。 10.5 记录 对生产全过程、血清保存和使用情况记录、归档。 __________________________ 3