ICS 65.150 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5126—2019 鲑鱼及其加工产品中转基因成分定性 PCR检测方法 Method of polymerase chain reaction for detecting genetically modified salmons and their derived products 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5126—2019 前言 本标准依照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国黄埔海关 本标准主要起草人：王勤、刘晓飞、王慧煜、李霆、林祥梅、付伟、李想、刘二龙、黄文胜、李晓琳、仇松寅、 刘丹丹、梅琳。 业标准信息服务平台 SN/T5126—2019 鞋鱼及其加工产品中转基因成分定性 PCR检测方法 1范围 本标准规定了大西洋鲑AAS及其产品中转基因成分荧光PCR检测方法。 本标准适用于大西洋鲑AAS及其产品中转基因成分（GH-AFP)的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T19495.3—2004转基因产品检测-核酸提取纯化方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AAS转基因大西洋鲑（AquAdvant GH 生长激素（growthhormone) AFP 标准信息服务平台 4 操作方法 以正 4.1 主要仪器 4.1.1 荧光PCR仪 4.1.2 超净工作台 4.1.3 台式冷冻离心机 4.1.4 涡旋振荡器 4.1.5 恒温水浴锅 4.1.6 一80℃冰箱或液氮罐 4.2 主要试剂 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。 4.2.1 蛋白酶K 4.2.2 乙酸钾 4.2.3 三氯甲烷：异戊醇，24：1 4.2.4 酚：三氯甲烷：异戊醇，25：24：1 1 SN/T 5126—2019 4.2.5 十二烷基磺酸钠（SDS) 4.2.6 TE缓冲液 4.2.7 乙醇 4.2.8 冰乙酸 4.2.9 氢氧化钾 4.2.10 探针法预混液（2×） 4.3 引物和探针 引物和探针序列见表1，扩增参考序列见附录A。 表1检测转基因鲑鱼外源基因所需的引物及探针序列 引物序列 被检测基因 探针序列 备注 上游：5'CATCTCCAGGGTTCGGTTTCC3' TCCGAGCAGCAAAGCC GH-AFP 外源基因 下游：5’CGTGGCATACACAGAGTGAGC3” ATGTAGCAAAGAC 上游：5'CACAGGGGAGCCAGGATG3' TGAGCCTGGATGACAA GH 内参基因 下游：5’CAGGTTCTGGTAGTAGTTCCCGTAG3' TGACTCTCAG 4.4 样品采集及核酸提取 4.4.1 样品采集 出版文 无菌采集鱼肉组织作为检测样品，将其放 （无菌离心管中，编号备用。 4.4.2 样品存放 式 采集的样品放置在一80℃冰箱或液氮中保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。 4.4.3 核酸的提取 参考GB/T19495.3一2004中A.1.5酚三氯甲烷-1法提取核酸，也可采用其他等效的商业化试 服务平台 剂盒。 4.5荧光PCR扩增 4.5.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设立 阴性对照：非转基因大西洋鲑基因组DNA； 空白对照：以双蒸水代替DNA模板。 4.5.2荧光PCR反应体系 荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。盖紧管盖，500r/min离心30s。 2