SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4611—2016 国境口岸斑点热群立克次体 巢式PCR 检测方法 Nested PCR detecting method for spotted fever group rickettsiae at frontier port 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4611—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫 局、军事医学科学院微生物流行病研究所。 本标准主要起草人：瀚文东、王艳梅、丁淑丽、程成、闫冀焕、徐宁、付维明、耿聪、孙毅、包力。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4611—2016 国境口岸斑点热群立克次体 巢式PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸斑点热群立克次体的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定 本标准适用于国境口岸人、医学媒介生物（蜱、螨等）以及宿主动物中斑点热群立克次体的巢式 PCR方法检测（除外R.helvetica、R.australis、R.bellii、R.canadensis4种立克次体）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因检验实验室技术要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 斑点热群立克次体spottedfevergrouprickettsiae;SFGR 引起斑点热的一组病原体，可引起包括落矶山斑点热、钮扣热、北亚热、昆士兰斑点热、立克次体痘 和日本红斑热在内的多种疾病·是天然寄生在螨和蜱体内并通过螨和蜱的叮咬传播给人或动物的专性 细胞性寄生菌。除个别的立克次体为螨传播外，其余均为蜱传播，具有明显的自然疫源性特征。主要媒 介蜱包括：草原革蜱、边缘革蜱、森林革蜱、中华革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、长角血蜱、亚洲璃眼蜱。 4检测对象 4.1疑似感染斑点热群立克次体的受染嫌疑人的血液样本 4.2从出入境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集的疑似感染斑点热群立克次体的游离蜱及以上 述场所宿主动物体表采集的寄生蜱。 4.3出入境交通工具、集装箱及口岸地区等场所捕获的疑似感染斑点热群立克次体的宿主动物 5生物安全和PCR防污染要求 5.1检测工作中的个人防护参照GB19489执行。 5.2进行标本检测的实验室应符合GB19489生物安全二级实验室要求。 5.3 使用过的实验用品应按照GB19489规定对废弃物的处理要求进行无害化处理。 1 SN/T 4611—2016 5.4 4PCR防污染措施按照WS/T230和SN/T1193的规定执行。 6仪器和耗材 本方法使用的主要仪器和设备如下： 扩增仪； 生物安全柜； 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）； 台式离心机（最高离心力2000g以上）； 漩涡振荡器； 恒温水浴锅； 高压灭菌锅； 低温冷藏、冷冻冰箱； 微量可调移液器（10μL、100μl、200μL、1000μL)及配套带滤芯吸头； Eppendorf管； 螺口塑料管。 7主要试剂 7.1 除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 7.2 核酸提取试剂：天根生化科技（北京）有限公司生产的细菌核酸提取试剂盒1）。 7.3PCR反应试剂如下： a) 10×PCR缓冲液(Mg²+plus)； b) dNTP(10 mmol/L); c) Taq 酶(5 U/μL); d) 阴性对照品（灭菌双蒸水ddH,O)； e) 阳性对照品（阳性的斑点热群立克次体）。 以上试剂也可由商品化试剂盒提供。 7.4电泳缓冲液（10×TBE）制备方法如下： 称取108gTris碱，7.44gNa2EDTA·H,O和55g硼酸，溶于800mL的ddHzO中，充分搅拌溶 解后加水定容至1L，室温保存。 7.56XLoading缓冲液（EDTA30mM,Glycerol 36%,XyleneCyanolFF0.035%,Bromophenol 息服务平台 0.05%)。 7.6GoldView核酸染料：使用浓度为0.05μL/mL。 8检测程序 8.1样本的采集、运送及保存 8.1.1血液样本 采集宿主动物或人全血标本，应常规无菌采集EDTA抗凝的血液样本至少1mL，4℃保存。样本 1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的 效果，则可使用这些等效产品。 2