ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 0 12-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品 眼刺激试验 体外重组类似人角 膜上皮模型测试 Cosmetics Eye Irritation test - In vitro Reconstructed human Cornea -like Epithelium(RhCE) test method 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.规范性引用文件 ……………………………………………………… …………… ……… 3 3.基本原理………………………………………………………… ………………… ……… 3 4 .仪器和试剂耗材 ………………………………… ………… ………………………… …… 3 5.试验方法 ………………………………………………………………………………… … 4 6.结果判定 …………………………………………………………………………………… 6 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海出入境检验检疫动植物与食品检验检疫技术中心、 上海家化联合股份有限公 司、伽蓝（集团）股份有限公司、 上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市 质量监督检验技术研究院 、玫琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物 科技有限公司 有限公司、 汉高（中国）投资有限公司、 广东博溪生物科技有限公司、 东阿阿胶股份有限 公司、上海日用化学 品行业协会 。 本标准主要起草人： 李小林、邱璐、丁诗璇 、陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、万 向红、李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品眼刺激试验 体外重组类似人角膜上皮模型测试 1 范围 本标准规定了化妆品原料及成品眼刺激试验 体外重组类似人角膜上皮模型测试试验方法。 本标准适用于化妆品原料及成品体外眼刺激性测试。 本标准可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一，可结合其他方法对眼刺激性进行综合评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 OECD 492 Reconstructed human cornea -like epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage 3 基本原理 体外重组人角膜上皮模型由正常人角质细胞的非角质化上皮构成，能够模拟多层 角膜上皮。受试物 涂布作用于三维重组类似人角膜上皮组织模型，一定时间暴露后经过清洗、孵育等步骤，通过 MTT试验 测试组织细胞生存率，从而判定受试物的刺激性。 4 仪器和试剂耗材 4.1 设备 4.1.1 二氧化碳培养箱 4.1.2 生物安全柜 4.1.3 多功能酶标仪 4.1.4 水浴锅 4.1.5 计时器 4.1.6 手术镊子 4.2 试剂耗材 4.2.1 重组类似人角膜上皮组织模型 4.2.2 6孔、12孔、24孔和96孔细胞培养板 4.2.3 DPBS溶液 4.2.4 MTT溶液 4.2.5 乙酰甲酯 4.2.6 去离子水 4 4.2.7 无菌移液管 5 试验方法 5.1 模型接收与准备 重组类似人角膜上皮模型经 4℃低温运输至实验室。运输过程全程需保持无菌，避免破损。模型接 收后，将模型室温放置 15min。将模型测试培养基放置 37℃水浴。将测试培养基加入 6孔板，每孔 1.0mL。 组织模型外包装用 70%乙醇消毒，去除无菌纱布，将组织模型小孔取出，注意小孔底部是否有气泡，如 有气泡则不可用。将组织小孔取出，注意去除凝胶，将其放入含培养基的 6孔板中，底部不得有气泡。 组织模型在 37℃含5%二氧化碳的二氧化碳培养箱（标准培养条件）中孵育 1h，去除原培养基，重新加入 1.0 mL测试培养基，在标准培养条件下孵育过夜（ 16-24h）。 5.2 对照选取 选择去离子水作为阴性对照，乙酸甲酯作为阳性对照。 5.3 受试物准备 5.3.1 测试物质 每个受试物及对照组均使用两只模型小孔，液体和固体受试物的测试步骤不同。液体受试物包括液 体及可吸取的物质，如液体、凝胶和膏状物。固体受试物包括不可吸取的物质，如粉末、树脂或蜡状物 质。 对于难以确定测试物状态的物质， 包括粘稠、 蜡状和类似凝胶的物质， 在测试前可在 37℃孵育15min， 如孵育后可吸取，则可按液体受试物测试，并在水浴条件下加入受试物，如不可吸取，则只能按固体受 试物测试。 5.3.2 受试物MTT反应测试 一些受试物可能与 MTT反应，形成蓝色或紫色反应物，从而对 MTT测试产生影响。因此，测试前需要 对受试物与 MTT的反应性进行检测。将受试物（液体 50μL或固体50mg） 加入到含 1mL MTT溶液的6孔板中， 在标准培养条件下避光孵育约 3h。阴性对照采用去离子水。如 MTT溶液出现变蓝或紫色，则受试物能够 减少MTT。如受试物能够减少 MTT，则需要加入死皮对照用于评价受试物是否导致的假 MTT反应。 5.3.3 有颜色或染色物质的测试 对于有颜色物质或应用时变色的物质如其粘附在组织上并与 MTT一起提取，其可能干扰 MTT的测试， 因此应考虑受试物的颜色属性。 对于本身能够吸收光，并呈现红色、黄色、绿色和蓝色的物质称为内在着色剂，其他物质如黑色能 够吸收光，也考虑为着色剂。蓝色、黑紫色和黑色物质需要增加颜色对照测试。这些受试物仍需要在死 皮对照上测试。 5.4 受试物测试 每个受试物应使用两个模型小孔。液体受试物和固体受试物测试步骤不同。通常情况下，先测试阴 性对照和阳性对照，之后测试受试物。受试物可以使用原液，也可根据产品使用方式、应用浓度等因素 确定受试物的测试浓度。 5.4.1 液体受试物 5.4.1.1 预处理 组织模型孵育过夜后取出，每孔加入 20μL 不含钙镁的 DPBS缓冲液进行润湿，在标准培养条件 （37℃,5% CO 2）孵育30min。 5 5.4.1.2 受试物暴露 每孔加入 50μL液体受试物及对照物，标准培养条件下暴露 30±2min，每个样品使用两个模型重复。 对于难吸取液体可采用粘液移液器进行吸取加样。 5.4.1.3 润洗 用DPBS对测试小孔润洗。分别使用 3个烧杯，每个加入 100mL DPBS 溶液，用镊子夹住两个模型小孔， 在第一个烧杯中润洗 2s，重复3次，第2个和第3个烧杯采用相同的方式润洗，在吸水纸上吸干孔内液体。 5.4.1.4 浸泡 将模型小孔放入含 5mL预热的测试培养基的 12孔板中浸泡 12±2min，去除模型 中残留的受试物。 5.4.1.5 孵育 取出浸泡的模型小孔， 吸干孔内液体， 将其置于含 1mL培养基的 6孔板内， 在标准培养条件下孵育 120 ±15min。 5.4.2 固体受试物 5.4.2.1 预处理 组织模型孵育过夜后取出，每孔加入 20μL 不含钙镁的 DPBS缓冲液进行润湿，在标准培养条件 （37℃,5% CO 2）孵育30min。 5.4.2.2 受试物暴露 每个模型小孔加入 50μL DPBS液体，加入 50mg受试物及对照物，轻轻晃动，确保受试物均匀分布在 模型小孔中。应避免受试物加入到培养基中。在标准培养条件下孵育 6h±15min。 5.4.2.3 润洗 受试物用 DPBS润洗，具体步骤 参照5.4.1.3。 5.4.2.4 浸泡 将模型小孔放入含 5mL预热的测试培养基的 12孔板中浸泡 25±2min，去除模型中残留的受试物。 5.4.2.5 孵育 取出浸泡的模型小孔，吸干孔内液体，将其置于含 1mL培养基的 6孔板内，在标准培养条件下孵育 18 ±0.25h。 5.5 MTT测试 5.5.1 取300μL 1.0mg/mL MTT 溶液加至 24孔培养板，将测试后的模型小孔放至 24孔板中，标准培 养条件下孵育 180±10min。 5.5.2 对于液体受试物，取出模型小孔，用吸水纸吸干底部液体，放入 24孔板中，每孔加入 2mL异丙 醇溶液。用封口膜将 24孔板封闭， 放至暗处 2-8℃过夜。如