SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4273—2015 国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法 Real time PCR detection methods of Banna virus at ports 行业标准信息服务平台 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4273—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫 局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：洪烨、丁国允、孙薇、周艳容、师永霞、郑夔、黄吉城、刘扬、戴俊、苏水宽、贺骥、 孙肖红、幸芦琴、李小波、钟玉清、相大鹏、郭波旋。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4273—2015 国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸版纳病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理，检验程序 方法及结果判定。 本标准适用于国境口岸版纳病毒的实验室检测 2缩略语 下列缩略语适用于本文件 实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 RNA：核糖核酸 FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 版纳病毒Banna virus 版纳病毒（Bannavirus,BAV)为12节段双链RNA病毒，是一种虫媒病毒，主要经蚊虫传播，可引 起人类发热和病毒性脑炎，目前该病毒主要分布在我国和印度尼西亚等地区。版纳病毒电镜下观察为 二十面体球形颗粒，表面有纤突，直径在60nm～70nm之间。病毒的基因组由12个节段的双链（dsR NA)组成，全长约为21000bp。 3.2 实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR 实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加人一套可反映PCR扩增过程的荧光报告系统，通 过监测系统接收到荧光信号，实时判断每个反应管内目的基因的模板扩增情况 4主要仪器设备 本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、I级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高 速离心机（最大离心力20000×g）玻璃研磨器、漩涡振荡器、冰箱（4℃、一20℃、一70℃或液氮罐）、移 液器等。 1 SN/T4273—2015 5主要试剂 本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂如Qiagen公司的QIAampViralRNAKit)、实时荧光 RT-PCR通用试剂如Ambion公司的Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKitl、PBS溶液（pH7.0）、无 RNA酶的DEPC水、引物和探针（针对版纳病毒Vp12基因片段编码区核苷酸高度保守区进行设计，引 物和探针序列见表1等。 表1版纳病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 引物/探针名称 序列（5'-3') 扩增片段大小 Banna-FP CGTAATTTTATGGACCACCTGGA Banna-RP 82 bp CATAAGAAGCATGGCGACCTAG Banna-probe FAM-CTACTGGTCCTGTGCCGTTAGGTCCC-BHQ1 6标本的采集与处理 6.1 人体标本 无菌采集发热期可疑病人的静脉血或脑脊液等标本3mL～5mL，血标本于室温静置30min使其 料管，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清或脑脊 液置于一70℃保存。 6.2蚊标本 将采集的蚊子直接放人一20℃冰箱30min以上冻死后，取出，分类编号，一般按30～50只一份， 不足30只的可按采样点或分类归为一份，装人2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号。于 一70℃以下运输或保存。蚊标本处理时应在冰上操作。从一70℃容器中取出蚊标本，倒入研磨器中， 加入PBS液1mL，反复研磨至组织碎片基本消失，随即将研磨液吸入1.5mL离心管，配平后置预冷 4℃的离心机上，12000r/min离心10min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，剩余的 蚊标本研磨液需保存在一70℃以下容器以备复查。 信息服 7病毒核酸提取方法 按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光RT-PCR检测。或一70C储存RNA待检 8 实时荧光RT-PCR检测 8.1 反应体系配制 配制20uL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水2.2uL、2×RT 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2