SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3971—2014 小反色兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法 Immunochromatographic assay of colloidal gold for detection of peste des petits ruminants 行业标准信息服务平台 2014-07-14发布 2015-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3971—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国西藏出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫 局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨俊兴、刘忠清、杨云庆、赤列加措、花群义、吕建强、祝贺、孙洁、艾军、唐金明。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3971—2014 小反兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法 1范围 本标准规定了小反台兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法。 本标准适用于小反兽疫抗体的快速检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白 ICS:免疫层析试纸 PBS:磷酸缓冲液 PPR：小反台兽疫 PPRV:小反鱼兽疫病毒 SPG:链球菌G蛋白 行业标准信息服务平台 4 主要设备 4.1 恒温箱。 4.2 电子天平：精确值0.0001g。 4.3 台式冷冻离心机：最大离心力15000 4.4 pH计。 4.5试纸喷膜仪 4.6 试纸条切割机：可连续切割出2mm5mm宽试纸。 5 主要试剂和材料 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合GB/T6682规定的三级水 5.11%氯金酸溶液（AuCls·HCI·3H,O）。 5.2PBS:配方见附录A。 5.3PPRVN蛋白：为基因工程表达蛋白抗原。 5.4 链球菌G蛋白（SPG)。 1 SN/T 3971—2014 5.5 51%柠檬酸钠溶液， 5.61%碳酸钾溶液（K,CO）：配方见附录A。 5.7抗SPG多克隆抗体。 5.8 3牛血清白蛋白。 5.9硝酸纤维素膜。 5.10玻璃纤维棉纸。 5.11干燥剂。 5.12PPRV阳性血清，由指定单位提供。 5.13 PPRV阴性血清，由指定单位提供。 6检测原理 将胶体金标记的SPG固定于金标垫，检测线为纯化的PPRVN蛋白，对照线为兔抗SPG。检测时， 阳性样品中的抗PPRV抗体与胶体金标记SPG特异性地结合，在NC膜上移动时，被检测线上的 PPRVN蛋白捕获，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。相反，阴性样品中不含抗PPRV 抗体，在检测线处不形成红色条带。对照线试剂免抗SPG与胶体金标记SPG结合，捕获金标复合物， 形成对照线。 7免疫胶体金试纸卡的组装 7.1 金标SPG及金标垫的制备 首先用1%碳酸钠溶液调胶体金溶液的pH值为6.5，向50mL胶体金溶液中缓慢地加入适量SPG 溶液，室温搅拌30min，缓慢加人10%BSA至其终浓度为1%（质量浓度），继续搅拌30min。4℃ 4000g离心10min，将上清转移至另一离心管中，4℃12000g离心30min，小心弃去上清。用5ml （即1/10原体积）PBS（pH7.0）重悬沉淀。加人1%（质量浓度）的叠氮钠（NaN：）溶液至终浓度为 0.02%，用试纸喷膜仪将胶体金溶液喷于300×5mm玻璃纤维棉上，速度为50μL/cm，并于4℃真空 抽干，于4℃干燥保存备用。 7.2检测线和对照线的制备 用纯化的浓度为2mg/mL的PPRVN蛋白和免抗SPGIgG分别作为检测线和对照线试剂。用试 纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点样速度为0.75μL/cm。37℃干燥2h，4℃密封保存 备用。 7.3 3试纸卡的组装 按图B.1所示，将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起，并用试纸条切割机将其切成 3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中，将试纸卡放入含有干燥剂的密封袋内，密封后于2℃～ 8℃保存备用。 8样品采集、处理和保存 采集动物血样，室温静置约30min，使血液自然凝固。5000g离心10min，收集上清液转移至另 时保存（不超过7d）或一70℃长期保存。样品的运输按SN/T2123执行。