SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3957—2014 冬虫夏草真伪鉴别 实时荧光PCR方法 Identification of Cord yceps sinensis (Berk.)Sacc.Real-time PCR 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3957—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局 本标准主要起草人：马骏、谢力、胡学难、陈源树、张隽、刘津、高东微 行业标准信息服务平台 SN/T 3957—2014 冬虫夏草真伪鉴别 实时荧光PCR方法 1范围 本标准规定了冬虫夏草真伪鉴别的实时荧光PCR方法。 本标准适用于冬虫夏草[Cordycepssinensis（Berk.）Sacc.J天然原料及其发酵菌丝体的实时荧光 PCR鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 Ct值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Tris：tris（hydroxymethyl）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷 EDTA:ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸 PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应 DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸 dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸 dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸 dCTP：deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸 dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸 dTTP：deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸 Taq：Thermusaquaticus，水生栖热菌 OD：opticaldensity，光密度值 4试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 1 SN/T 3957—2014 用无DNA酶污染的容器分装。 4.1十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide，CTAB）。 4.2三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]。 4.3乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA):pH8.0。 4.4三氯甲烷（CHCI）。 4.5Tris饱和酚(pH8.0)。 4.6异丙醇(CH.O)。 70%乙醇。 4.8裂解液:2%CTAB[100mmol/LTris-HCl（pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，1.4mol/L NaCl，1%（体积分数）］。 4.9乙酸钠溶液（3mol/L，pH5.2）。 4.10 TE 缓冲液（Tris-CI、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。 4.11实时荧光PCR缓冲液。 4.12引物探针： 正向引物:5'-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3 反向引物：5-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3 探针:5'-(FAM)-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-(TAMRA)-3 5仪器设备 5.1 PCR 仪。 5.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.3 恒温水浴锅（5℃~80℃精度土0.1℃） 5.4 离心机：离心力12000g。 标准信息服务平台 5.5微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000pL）。 5.6 涡旋振荡器。 5.7pH计（分辨率0.001pH)。 5.8核酸蛋白检测仪。 5.9核酸、蛋白真空干燥仪。 5.10 天平：感量0.0001g。 6试样选取与制备 将实验样品粉碎，充分混合均匀后待用。 7检验步骤 7.1样品的总DNA提取 7.1.1CTAB方法 CTAB提取：取一段经双蒸水洗净的虫草子实体或菌丝体（参见附录A），干样5mg～10mg， 鲜样10mg~30mg置于1.5mL离心管中，加100μL20g/LCTAB裂解液用微型研将虫 2