SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3327—2012 猪瘟病毒逆转录环介导等温 核酸扩增检测方法 Quarantine protocal for classic swine fever virus by loop-mediated isothermalamplification 行业标准信息服务平台 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3327—2012 行业标准信息 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 猪瘟病毒逆转录环介导等温 核酸扩增检测方法 SN/T3327—2012 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013） 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)64275323 网址 www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75字数12千字 2013年6月第一版2013年6月第一次印刷 印数1—1600 * SN/T3327-2012 书号：155066·2-25384定价16.00元 SN/T3327—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局 本标准主要起草人：李健、熊炜、张强、蒋静、邱璐、王巧全、黄忠荣、胡永强。 行业标准信息服务平台 SN/T3327—2012 猪瘟病毒逆转录环介导等温 核酸扩增检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒逆转录环介导等温核酸扩增检测的操作方法。 本标准适用于猪瘟病毒的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489—2008实验室生物安全通用要求 3概述 猪瘟（classicalswinefever，CSF），是由猪瘟病毒（classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种急 性、热性、高度接触性传染病，对猪养殖业危害极为严重。CSFV基因型为单股正链RNA，基因组长约 123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架（ORF）。本标准利用环介导等温核酸扩增技术在恒温条件下 快速、高效、特异地扩增位于猪瘟病毒5端非编码区（5-UTR）的靶序列，从而达到快速检测的目的。 4试剂和材料 4.1BstDNA聚合酶（大片段）：酶浓度为8U/uL，-20℃保存，避免反复冻融。 4.210倍ThermoPol聚合酶浓缩缓冲液：一20℃保存。 4.3硫酸镁溶液（MgSO,）：浓度为25mmol/L，一20℃保存。 4.4AMV逆转录酶：逆转录酶浓度为5U/uL，一20℃保存，避免反复冻融。 务平台 4.5 甜菜碱溶液（Betaine）：浓度为5mol/L，一20℃保存，避免反复冻融。 4.6 dNTPs:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L,一20℃保存。 4.7LAMP引物：引物配成浓度25μmol/L，一20℃保存备用。其序列如下： 正向外引物(CSFV-F3）:5-AGC-TCC-CTG-GGT-GGT-CTA-3; 反向外引物（CSFV-B3)：5²-CCT-AAT-AGT-GGG-CCT-CTG-CA-3； -正向内引物（CSFV-FIP）:5'-GCC-CTC-GTC-CAC-ATA-GCA-TCT-CAG-TAC-AGG-ACA GTC-GTC-AGT-3'; 一反向内引物(CSFV-BIP):5'-GCC-CAA-GAC-ACA-CCT-TAA-CCC-TTC-AGG-TCG-TAC TCC-CAT-CAC-3'; 正向环引物（CSFV-LF:5"-GGG-CTT-CTG-CTC-ACG-TCG-3； 反向环引物（CSFV-LB）：5'-GGT-CGC-TAG-GGT-GAA-ATC-3’。 4.8SYBRGreenI荧光染料溶液：-20℃保存。 1