ICS 71.100.70 C2682 Y42 团 体 标 准 T/SHRH 024-2019 ________________________________________________________________________________________ 化妆品眼刺激性试验 体外重组 3D角膜模型半数 有效时间测试方法（ ET50） Eye irritati on test of cosmetics -In vitro reconstructed cornea model -Time to toxicity test method （ET 50） 2019-12-30发布 2020-01-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 目 次 T/SHRH 全国团体标准信息平台 T/SHRH 024-2019 1 前言…………………………………………………………………………………………… 2 1．范围……………………………………………………………… ………………………… 3 2. 规范性引用文件 ………………………………………………………………………… 3 3. 术语、定义 ……………………………………………………………………………… 3 4. 试剂及仪器设备 ………………………………………………………………………… 3 5. 试验步骤 ………………………………………………………………………………… 4 6. 结果计算 ………………………………………………………………………………… 5 7. 质量控制 ………………………………………………………………… ……………… 5 附录A： 资料性附录 …………………………………………………………………………… 6 附录B： 资料性附录 …………………………………………………………………………… 7 全国团体标准信息平台 T/SHRH 024-2019 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1 -2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准的某些内容可能涉及专利，本 标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位： 广东博溪生物科技有限公司、 上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限 公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生 物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天祥质 量技术服务有限公司、 上海日用化学品行业协 会。 本标准主要起草人： 李潇、张晓娥、张艳云、 曹平、陈田、 陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳、 陈贞 明、谢阿贵 、廖峰、姜春鹏、赵奕竹 、马骁、王飞飞 、高宏旗、朱翠翠、 李琼、金坚、陈亦华。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 024-2019 3 化妆品眼刺激性试验 体外重组 3D角膜模型半数 有效时间测试方法（ ET 50） 1 范围 本标准规定了 一种基于体外重组 3D角膜模型的 眼刺激性 测试方法。 本标准适用于 化妆品原料和 成品的眼刺激性测 试。 本标准可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一 ，可结合其他方法对眼刺激性进行综合分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引 用文件，仅注日期的版本适用于本 文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27830 -2011 化学品 体外皮肤腐蚀 人体皮肤模型试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语、定义 3.1眼刺激性 eye irritation 眼前部直接接触 待测物后，引起的眼及周围粘膜组织可逆性炎性 损伤。 3.2细胞活性 cell viability 测定细胞群体总活力的指标 [如细胞线粒体脱氢酶还原活性染料噻唑蓝（ 3-（4，5-二甲基噻唑 -2） -2，5-二苯基四氮唑溴盐， MTT）的能力 ]，指标的测定取决于试验终点和所用的设计方案，并与细胞 总数和活性细胞数量有关。 3.3半数有效时间 median effective time，ET50 待测物在固定浓度下导致细胞存活率降低 50％所需的暴露时间。 3.4吸光度 optical density, OD 入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下，同一 种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。 4 试剂及仪器设备 4.1试剂和材料 4.1.1 体外重组 3D角膜模型 （BioOcullar®）。 4.1.2 体外重组 3D角膜模型培养 液（ BioRecovery 培养液）。 4.1.3磷酸盐缓冲液 （PBS）。 4.1.4 Triton X -100 (0.3%，V/V)。 4.1.5 MTT（CAS No.298 -93-1）。 4.1.6 异丙醇。 4.2 仪器和设备 4.2.1 移液器： M25活塞排代式移液器 及相应吸头 ，20μL~200μL 、100μL~1000μL 移液器及相应吸头 。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 024-2019 4 4.2.2 CO 2培养箱： 37℃±1℃，（ 5±1）%CO 2，95%相对湿度。 4.2.3 酶标仪： 570nm。 4.2.4 超净工作台 。 4.2.5 水平振荡仪 。 4.2.6 分析天平（精度 0.1mg）。 5 试验步骤 5.1 准备工作 5.1.1待测样品与 MTT反应 用PBS缓冲液配置 5mg/mL的MTT母液，将 MTT母液用 PBS稀释至 1mg/mL的MTT工作液。 取一个 24孔板，对待测样品进行单孔试验（根据待测样品数量确定 24孔板数量），每个 24孔中设置 一个对照孔。每孔中加入 2mL的MTT工作液，将 80µ L或80mg待测样品加入 MTT反应孔中，置于 CO 2培养箱（ 37± 1℃、5± 1%CO 2、95%相对湿度）中，孵育 3h。观察与对照孔是否有颜色差异，若 MTT溶液出现变蓝或紫色，说明待测样品与 MTT反应，后续测试中需使用致死模型去掉非特异性吸 光度值。若无颜色反应，则无需制备致死模型。 5.1.2制备致死模型 将体外重组 3D角膜模型转移至 24孔板中，每孔加入 2mL无菌去离子水，置于 4℃静置 24h后， 将角膜模型转移至 -20℃冰箱保存，不超过 6个月。 5.1.3模型准备 体外重组 3D角膜模型接收后，确认外观无破损，模型表面无 液体渗出或收缩现象 。确认完毕后， 根据模型数量 ，按照 3个模型 /6孔板，准备 6孔板，并在每个孔中加入 0.9mL BioRecovery 培养液。 将体外重组 3D角膜模型转移至 6孔板后，置于 CO 2培养箱（ 37± 1℃、5± 1%CO 2、95%相对湿度）中， 孵育 60± 5min。培养结束后，用无菌镊子将模型从 6孔板的第一 排转移至第二排后，将6孔板放回 至 CO 2培养箱（ 37± 1℃、5± 1% CO 2、95%相对湿度）中 ，孵育过夜（ 18± 3h）。 5.1.4待测物预处理 粘稠、蜡状、树脂状、凝胶状 待测物需 在37± 1℃条件下预处理 15± 1min，预处理结束后，如果使 用移液器 可以吸取，则视为液体；若不能则 视为固体。粉末状、颗粒状等 待测物以固体对待。固体受 试物需研磨至粉末方可进行给药。 5.2给药 固体待测物用分析天平 称取 80mg，给药漏斗轻 置于模型表面 ，使待测物 均匀铺展。液体待测物 吸取 80µL，均匀滴加于模型表面。洗去型化妆品待测物需进行一定比例稀释，驻留型化妆品待测物原 液给药。 5.3后孵育 阳性对照 （0.3% TritonX -100）给药后孵育时间设置为 0min，15min，30min，45min； 洗去型化妆品待测物的给药后孵育时间设置为 0min，15min，45min，90min； 驻留型化妆品待测物的 给药后孵育时间设 置为： 0h，6h，16h，24h； 给药后孵育 时间也可根据待测物特性进行微 调。 5.4清洗 模型孵育培养结束后 ，开始清洗程序。用无菌 PBS溶液重复清洗模型表面 10次，去除 残留的待 全国团体标准信息平台 T/SHRH 024-2019 5 测物。每个模型的清洗总时间需控制在 1~2min。 5.5 MTT反应 根据模型总数量准备 24孔板，并 向每孔加入 0.3mL 的 MTT工作液。将模型转移至