SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2635—2010 水稻瘤矮病毒的检疫鉴定方法 Detection and identification of rice gall dwarf virus 行业标准信息服务平台 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2635—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫 局、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、高芳銮、朱水芳、郭琼霞、王念武、虞赞、黄可辉、吴祖建。 行业标准信息服务平台 I SN/T2635—2010 水稻瘤矮病毒的检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了水稻瘤矮病毒检疫鉴定的程序和方法。 本标准适用于水稻上水稻瘤矮病毒的检测。 2原理 水稻瘤矮病毒学名：ricegalldwarfvirus，缩写：RGDV。水稻瘤矮病毒的分子生物学特性是本标准 制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、病毒基因组 等参见附录A。 3仪器设备、用具及试剂 3.1仪器设备 高速冷冻离心机、微量天平（1/1000g）、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像 分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。 3.2用具 各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)、PCR反应管、无RNase离 业标准信息服务平台 心管（1.5mL）、研钵等。 3.3试剂 3.3.1TrizoL裂解液。 3.3.25XTBE缓冲液 Tris 碱 54.0 g 硼酸 27.5 g 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL 补充蒸馏水至1L。 3.3.36×加样缓冲液 0.25%溴酚蓝 40%（质量浓度）蔗糖水溶液。 3.3.4三氯甲烷。 3.3.5异丙醇。 3.3.675%乙醇。 3.3.7无水乙醇。 3.3.8RT缓冲液。 3.3.9dNTP:10 mmol/L。 1 SN/T 2635—2010 3.3. 10 M-MLVRT:200 U/μL 3.3.11 Rnasin:40 U/μL。 3.3.12TaqDNA聚合酶。 3.3.13PCR缓冲液。 3.3.14 氯化镁：25mmol/L。 3. 3. 15 表1RT-PCR的引物 引物名称 引物序列 产物大小 退火温度 RGDV1 5'-CATTACTGTGCCGACCGAC-3' 778 bp 55℃ RGDV2 5'-ACACGACCCGCCTGTTACT-3 表2 实时荧光RT-PCR的引物和探针序列 引物名称 引物序列 RGDVf 5'-ACTGTCGAAATTCGAACGAGGTA-3 RGDVr 5′-GGCACTCCGGTTTCAGCAT-3' RGDV-Probe 5'-(FAM)TCCTACTCCCTTCAATCCAGCGCGA(TAMRA)-3" 检测与鉴定 4.1总RNA提取 称取0.1g样品组织，用液氮研磨成粉末状，迅速转移至灭菌的1.5mL离心管中，并加入1mL TrizoL试剂，剧烈振荡后，室温静置5min；4℃，12000g离心10min，取上清液；加人三氯甲烷200uL， 剧烈振荡15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混 匀后室温下静置5min；4℃，12000g离心10min，弃上清液；加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，每 次4℃，7500g离心5min，弃上清液；RNA沉淀干燥后，用20μL~40L经DEPC（焦碳酸二乙酯）处 理过的ddH,0溶解，一20℃保存备用。 4.2cDNA合成 在PCR管中加人3μL总RNA，1μLRGDV2引物，95℃水浴7min，迅速冰浴5min。再加人下 列试剂：5XRT缓冲液2.5μL、dNTP(10mmol/L)0.5μL、M-MLVRT(200U/uL)0.5μL、Rnasin （40U/μL)0.5μL、ddH，O4.0μL。37℃水浴60min，95℃水浴10min，自然冷却至室温，一20℃保 存备用。 4.3RT-PCR扩增 PCR反应体系见表3，每个反应设置2个重复。检测时以含有RGDV目标片段的质粒或含病毒材 料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模扳作为空白对照。 2