SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2552.10—2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第10部分：阪崎肠杆菌检验 免疫荧光方法 Microbiological examination for milk and milk products hygiene- Part 1O:Detection of Enterobacter sakazakii- Fluorescent antibody method 标准信息服务平台 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2552.10—2010 前言 SN/T2552《乳及乳制品卫生微生物学检验方法》分为十三个部分： 第1部分：取样指南； 第2部分：检验样品的制备与稀释； 第3部分：酵母、霉菌菌落计数； 第4部分：嗜冷菌微生物菌落计数； 第5部分：沙门氏菌检验； 第6部分：柠檬酸杆菌检验； 第7部分：阴沟肠杆菌检验； 第8部分：普通变形杆菌和奇异变形杆菌检验； 第9部分：克雷伯氏菌检验； 第10部分：阪崎肠杆菌检验、免疫荧光法； 第11部分：蜡样芽孢杆菌的分离与计数； 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数； 第13部分：假单孢菌属的分离与计数。 本部分是SN/T2552的第10部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：杨捷琳、赵贵明、袁飞、顾鸣、袁辰刚、韩伟、关嵘、杨海荣。 行业标准信息服务平台 I SN/T2552.10—2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第10部分：阪崎肠杆菌检验 免疫荧光方法 1 范围 SN/T2552的本部分规定了乳粉中阪崎肠杆菌的免疫荧光检验方法。 本部分适用于乳粉中阪崎肠杆菌的快速筛选，乳制品可参照使用。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1632.1奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分：分离与计数 SN/T2552.1乳及乳制品卫生微生物学检验方法第1部分：取样指南 3溶液与试剂 3.1PBS缓冲液：见附录A第A,3章。 3.2固定液：见附录A第A.4章。 3.3pH9.0碳酸盐-甘油缓冲溶液：见附录A第A.5章。 3.4阪崎肠杆菌多克隆抗体或单克隆抗体试剂及异硫氰酸荧光素（FITC)标记的山羊抗小鼠荧光抗体 选用商品化的以阪崎肠杆菌单克隆抗体和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗小鼠Fab荧光抗 体，染色时应按照试剂标明的常规染色工作浓度和稀释方法进行稀释后使用。 注1：所用荧光抗体应在有效期以内。 注2：已稀释的荧光抗体试剂置4℃储存可使用1个月左右，保持其固有的染色亮度不变，如发现其染色亮度下降， 信息服务平 则不能继续使用。 4设备与材料 4.1载玻片 76mmX26mm，厚度0.8mm~1.0mm，事先刻好编号及八个小方格，自左至右排列，每行四格 上下共两行（或采用供免疫荧光技术专用的多凹涂膜载玻片），用洗涤剂彻底清洗油污，擦洗干净，并经 滴水检查证实无油污后，再浸于95%乙醇中保存备用。 4.2盖玻片 22mmX22mm，厚度0.13mm~0.17mm，按同上方法进行去油污处理。 4.3荧光显微镜 具有投射光或落射光光源装置，配装能投射波长为330nm～350nm的激发滤片与接受波长大于 400nm的阻断滤片。 1 SN/T2552.10—2010 5测定方法 5.1试样制备 抽样和制样按SN/T2552.1执行。无菌称取样品100g至2L的样品稀释瓶中，加人900mL预热 到45℃的灭菌蒸馏水，或者将样品直接称量到装有9倍于样品质量，并已预热到45℃的灭菌蒸馏水的 样品稀释瓶中，振摇使样品充分混匀，36℃土1℃培养18h～22h。 5.2染色 5.2.1染色步骤参见附录B。以直径3mm的接种环经培养的增菌液一环，制成较薄的标本涂片，置 37℃恒温箱（或室温）充分晾干后，用无水乙醇-三氯甲烷-甲醛固定液固定5min~10min，再用95%乙 醇浸洗后晾干（此项乙醇重复使用以不超过三次为宜）。 5.2.2将阪崎肠杆菌多克隆抗体或单克隆抗体试剂按染色工作浓度滴加于各标本涂片上，放湿盒内， 置37℃30min后取出，用0.01mol/LpH9.0PBS冲去多余的抗体，另换相同PBS浸洗10min，再以 蒸馏水冲洗后晾干。 5.2.3将羊抗小鼠荧光抗体试剂按染色工作浓度滴加于各标本涂片上，放湿盒内，置37℃30min后 取出，用0.01mol/LpH9.0PBS冲去多余的荧光抗体，另换相同PBS浸洗10min，再以蒸馏水冲洗后 晾干。 5.2.4滴加pH9.0碳酸盐-甘油缓冲溶液后，加盖玻片封片。 注1：对所用荧光抗体之染色工作浓度，必要时可用已知标准菌种重新测定 注2：每次涂片检查时皆应用1至数个已知染色阳性菌种作为对照实验。 6镜检及结果报告 6.1镜检 先用低倍物镜扫视整个标本，再换高倍物镜进行观察，并记录染色亮度与菌量等情况。 菌体荧光染色亮度评定标准如下： a）4十：黄绿色闪亮荧光，菌体周围及中心轮廓清晰 b）3十：黄绿色明亮荧光，菌体周围及中心轮廓清晰； c）2十：黄绿色荧光较弱，菌体周围及中心轮廓清晰； d）1十：仅有黯淡的荧光，菌形不清晰； e）一：无荧光或菌形不清。 6.2结果判定 6.2.1每个样品制备2个～3个涂片，镜检观察时应结合发荧光菌体的形态与菌量综合判定。 6.2.2阳性及可疑阳性结果：菌体荧光亮度达到2十左右，菌体形态特征基本符合阪崎肠杆菌短杆状 形态，且多数视野中均能检出数个菌体以上。由于抗体与细菌的结合有可能是多价的，观察时菌体形态 6.2.3阴性结果：荧光亮度在2十以下（不包括2十），且不属于可疑阳性结果范围者，均为阴性。 6.3报告方法 6.3.1荧光染色镜检为阴性结果：报告为“未检出阪崎肠杆菌”。 6.3.2荧光染色镜检为阳性或可疑阳性结果：按SN/T1632.1继续进行培养法检查，并根据培养法检 查结果做报告。 2