SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2474—2010 大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法 Detection of Phytophthora sojae with real-time PCR 行业标准信息服务平台 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2474—2010 前言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、南京农业大学、中华人民共和国辽宁出 人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国 黑龙江出入境检验检疫局、中国农业大学。 本标准主要起草人：章桂明、王源超、吴际云、彭金火、严进、程颖慧、王颖、易建平、崔澍、杨伟东、 杨立群、聂文革、缪建锟。 本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T 2474—2010 大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了大豆疫霉病菌（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)的实时荧光PCR检测 鉴定方法。 本标准适用于大豆夹杂的土壤传带大豆疫霉病菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法 3原理 3.1分类学地位 学名:Phytophthora sojae Kaufmann &.Gerdemann 病害名称：大豆疫霉病菌；常用英文名：SoybeanPhytophthoraRootRot 分类地位：藻菌界Chromista，卵菌门Oomycota，腐霉目Pythiales，腐霉科Pythiaceae，疫霉 属Phytophthora 3.2实时荧光PCR 利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体 系中荧光信号的变化，根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，得出大于平均值的荧光值即阅值，收 集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数，即Ct值。根据Ct值判断样品是否带有大豆疫霉 病菌。 4取样方法 空信息服务平台 5仪器和试剂 5.1主要仪器 5.1.1烘箱。 5.1.2高压灭菌锅。 5.1.3摇床。 5.1.4水浴锅。 5.1.5纯水仪。 5. 1. 6 高速冷冻离心机。 5. 1. 7 实时荧光PCR仪。 5. 1. 8 微量移液器（0.1μL~2.5μL，2μL~20μl，20μL~200μL，100μL~1000μL）。 5. 1. 9 真空抽干仪。 SN/T 2474—2010 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 5.2.1CTAB提取液：2%CTAB(质量浓度),100mmol/LTris·C1(pH8.0),20mmol/LEDTA (pH8.0),1.4mol/L氯化钠。 5.2.2Tris饱和。 5.2.3三氯甲烷。 5.2.4异戊醇。 5.2.5异丙醇。 5.2.6无水乙醇。 5.2.7 RNase. 5.2.8PCR反应试剂:PCRBuffe、氯化镁、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP）、SBYRGREENmix、 Taq Man master mix. 5.2.9醋酸钠。 6检测与鉴定 6.1土壤中卵孢子核酸制备 6.1.1将试样研磨，过120目筛。置于样品瓶中，密封，并标明标记。 6.1.2清洗实验器皿，于121℃，30min湿热灭菌或180℃干热灭菌1h。 6.1.3称取5g磨成粉末状的土样，倒人锥形瓶中，加150mL无菌水，再加10uL～20μL吐温，混匀， 260r/min摇动15min。 6.1.4将处理过的土样液倒人200目的筛网过筛，用清水不断冲洗；将下层冲洗液倒入400目的筛网 抽气过筛，用清水不断冲洗；再次将下层冲洗液倒人750目的筛网抽气过筛，最后将筛网上卵孢子收集 物倒入研钵，60℃烘干。 6.1.5将烘干的卵孢子收集物加液氮进行充分研磨，然后加4mL预热的CTAB抽提液，部分抽提液 用于洗涤研钵。 6.1.6将离心管放人水浴锅前先振荡1min，然后放人65℃水浴锅水浴15min，每隔3min~5min振 荡一次。 6.1.7加三氯甲烷4mL，用移液器混匀1min，冰浴10min；4℃，13000g离心15min，取上清液加等 体积异丙醇，轻轻摇匀，然后-20℃静置15min。 热鼓风烘箱或微量浓缩器进行干燥，电热鼓风干燥箱温度设为75℃，微量浓缩器温度设为60℃：加人 信息服务平 适量的去离子水，50μL～100μL。 6.2实时荧光PCR检测 6.2.1SYBRGREEN法 6.2.1.1引物序列 PS1引物序列：5'-CTGGATCATGAGCCCACT-3" PS2引物序列:5°-GCAGCCCGAAGGCCAC-3" 台 6.2.1.2扩增体系及条件 0.25μL,10μmol/L引物PS1和PS2各2.5μL,20XSYBRGreen12.5μL,5U/μLTaq酶0.25μL, 模板DNA5μL，补充去离子水至50μL。将反应体系混匀后置于实时荧光PCR仪中进行反应。 反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有大豆疫霉病菌的DNA作为模板，阴性对照以不含有 大豆疫霉病菌DNA作为模板，每个样品重复2次。 2