SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2206.10—2014 化妆品微生物检验方法 第10部分：金黄色葡萄球菌 PCR 法 Determination of microorganism in cosmetics- Part 10:PCR method for Staphylococcus aureus in cosmetics 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2206.10—2014 前言 SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌； 第3部分：肺炎克雷伯氏菌； 第4部分：链球菌； 第5部分：肠球菌； 第6部分：破伤风梭菌； 第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原； 第8部分：白色念珠菌； 第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌； 第10部分：金黄色葡萄球菌PCR法； 第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法； 第12部分：绿脓杆菌PCR法； 第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌。 本部分为SN/T2206的第10部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：房保海、王波、姜英辉、刘会梅、李正义、杨捷琳、吕蓉、贾俊涛、雷质文、孙涛。 标准信息服务平台 I SN/T 2206.10—2014 化妆品微生物检验方法 有PCR法 第10部分：金黄色葡萄球菌 1范围 SN/T2206的本部分规定了化妆品中的金黄色葡萄球菌PCR检测方法。 本部分适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB7918.1化妆品微生物标准检验方法总则 GB7918.5化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件 业标准 3.1术语和定义 3.1.1 金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus 息服务平台 为革兰氏阳性细菌，球形，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应，简称PCR（polymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） Taq：水生栖热菌（Thermosaquaticu） 4方法提要 化妆品经增菌后，提取增菌液或可以菌落的DNA，以提取的DNA为模板进行金黄色葡萄球菌高 保守片段的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对化妆品中是否污染金黄 色葡萄球菌进行快速检验筛选。 1 SN/T 2206.10—2014 5试剂和耗材 5.1SCDLP液体培养基（见A.1）。 5.2PCR扩增引物：上游引物：5-GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG-3，下游引物：5²-TTAAC CGTATCACCATCAATCG-3’，扩增长度247bp，扩增的特异性DNA序列片段和引物对应的位置见 附录 B。 5.3G+细菌基因组DNA纯化试剂盒或其他有效试剂。 5.4核酸裂解液：2%CTAB,100mmol/LTris-HCl(pH8.3)，1.4mol/L氯化钠，20mol/LEDTA (pH 8.0)。 5.5异丙醇。 5.670%乙醇：70%无水乙醇，30%灭菌双蒸水（体积比）。 5.7灭菌双蒸水，应符合GB/T6682一2008中一级水的规格。 5.810×PCR缓冲液（见A.2）。 5.9dNTP:10mmol/L，每种2.5mmol/L。 5.10琼脂糖（电泳纯）。 5.11DNA分子量标志物（50bp~500bp）。 5.12GelRed或GelGreen核酸染色剂。 5.136X上样缓冲液：30mmol/LEDTA36%（体积分数）甘油、0.05%（质量浓度）二甲苯睛蓝FF、 0.05%（质量浓度）溴酚蓝。 5.1450XTAE缓冲液（见A.3）。 5.15Eppendorf管和PCR反应管。 行业标准信息服务平台 6仪器设备 6.1恒温培养箱：36℃±1℃ 6.2 PCR仪。 6.3电泳仪。 6.4凝胶分析成像系统。 6.5冷冻离心机：离心力12000g。 6.6百 可调移液器：2.5μL、10μL、100μL、1000μL。 7操作步骤 7.1样品制备和增菌 参照GB7918.1进行样品的制备，参照GB7918.5在SCDLP液体培养基中进行增菌。 7.2模板DNA的提取 7.2.1从7.1样品增菌液表层取1mL培养液，离心收集细菌（4000r/min，10min），按照细菌基因组 存备用）。 （4000r/min，10min），去上清液。加人600μL核酸裂解液，重新悬浮细菌。100℃水浴5min后，冷 2