ICS 67.050 SN CCS C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5439.4—2022 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法第4部分：克罗诺杆菌 Rapid detection of foodborne pathogens from exported food by PCR-Lateral flow dipstick method-Part 4:Cronobacter 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 5439.4—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T5439的第4部分。SN/T5439已经发布了以下部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：金黄色葡萄球菌； 第3部分：副溶血性弧菌； 第4部分：克罗诺杆菌； 第5部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌0157； 第6部分：空肠弯曲菌； 第7部分：单核细胞增生李斯特氏菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国南京海关、中华人民共和国上海海关、南京农业大学、合肥工业大 学、苏州蝌蚪生物技术有限公司、广东省科学院微生物研究所、广东环凯生物科技有限公司、杭州傲敏生 物科技有限公司。 本文件主要起草人：袁辰刚、孙欣、薛峰、蒋原、曾海燕、蔡淑珍、曲晓莹、申进玲、陈伟、曾德新、 戴建君、苏静、陆寿祥、曾静。 SN/T 5439.4—2022 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法第4部分：克罗诺杆菌 1范围 本文件规定了出口食品中食源性致病菌-克罗诺杆菌快速检测的PCR-试纸条方法。 本文件适用于出口食品中克罗诺杆菌的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文 本文件。 GB4789.40一2016食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 出版文 克罗诺杆菌Cronobacter 其为革兰氏阴性无芽孢杆菌，具有周生鞭毛、有动力，兼性厌氧，大多数产黄毒素，具有α-葡萄糖苷 酶活性，是一种常见的病原菌 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid) FITC:异硫氰酸盐（fluorescein5-isothiocyanate） Tris：三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane 5方法原理 对样品中克罗诺杆菌进行增菌培养后提取DNA，采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐 标记的克罗诺杆菌的特异性检测引物进行PCR扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的 抗体，可与PCR产物上的异硫氰酸盐标记分子结合，在检测线位置上有抗地高辛抗体，可与PCR产物 上的地高辛标记分子结合，从而显色。如模板未扩增，则无PCR产物与地高辛抗体及FITC抗体结合， 从而不能在检测线（T线）位置显示颜色。 1 SN/T5439.4—2022 6 试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。 6.1引物 克罗诺杆菌扩增引物详见表1，靶基因序列参见附录A。 表1试验用引物 致病菌种类 靶基因 引物序列（5'→3°） 5'端标记物 片段长度 F:5′-CAGGAGTTGAAGAGGTTTAACT-3' 地高辛 ITS-IA 克罗诺杆菌 250 bp R:5'-GTGCTGCGAGTTTGAGAGACTC-3' 异硫氰酸盐 ITS-G&ITS-A 6.2试剂 6.2.1 DNA提取液:20 mmoL/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,1.2% Triton X-100(pH8.0)。 6.2.22XPCR预混液。 6.2. 3 3PCR引物 6.2. 4 试纸条：通过采购的原料试剂自行组装（参见附录B），或采用等效的商品化试纸条。 6.2. 5 展开液：10mmol/LTris、1%BSA、1%（体积分数）Tween20以及浓度为0.05mol/L的 NaOH；或采用等效的商品化产品。 7 仪器设备 式出版 7.1离心机：离心力12000g。 7. 3 PCR 仪。 恒温水浴锅：100℃±1℃。 7. 4 标准信息服务平台 7.5 天平：感量0.01g。 7. 6 pH计。 7.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 8 检验步骤 8.1样品制备和增菌 按照GB4789.40—2016的方法进行样品制备和增菌。 8.2 样品DNA提取 8.2.1 增菌液模板DNA的制备 对于8.1获得的增菌液，采用如下方法制备模板DNA： a） 吸取1mL菌液加人1.5mL离心管中，12000g离心3min，弃上清； b) 加人1mL0.85%无菌生理盐水，完全溶解沉淀，12000g离心3min，弃上清； 2