SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4675.29—2016 出口葡萄酒中酒香酵母检验 实时荧光PCR法 Determinetion of Brettanomyces bruxellensis in wine for export- Real-time PCRmethod 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4675.29—2016 前言 SN/T4675《出口葡萄酒质量安全分析方法》共分为30个部分： SN/T4675.1：出门葡萄酒中甘油的测定酶法； SN/T4675.2：出口葡萄酒中2，3-丁二醇的测定气相色谱法； SN/T4675.3：出口葡萄酒中乙醇稳定碳同位素比值的测定； SN/T4675.4：出口葡萄酒中乳酸的测定酶法； SN/T4675.5：出口葡萄酒中有机酸的测定离子色谱法； SN/T4675.6：出口葡萄酒中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定； SN/T4675.7：出口葡萄酒中乙醛的测定气相色谱-质谱法； SN/T4675.8：出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定液相色谱法； SN/T4675.9：出口葡萄酒中二甘醇的测定气相色谱-质谱法； SN/T4675.10：出口葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定液相色谱-质谱/质谱法； SN/T4675.11：出口葡萄酒中7种花色苷的测定超高效液相色谱法； SN/T4675.12：出口葡萄酒中溶菌酶的测定液相色谱法； SN/T4675.13：出口葡萄酒中2，4，6-三氯苯甲醚残留量的测定气相色谱-质谱法； SN/T4675.14：出口葡萄酒中纳他霉素的测定液相色谱-质谱/质谱法； SN/T4675.15：出口葡萄酒中水杨酸、脱氢乙酸和对氯苯甲酸的测定液相色谱法； SN/T4675.16：出口葡萄酒中富马酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法； SN/T4675.17：出口葡萄酒中丁基锡含量的测定气相色谱-质谱/质谱法； SN/T4675.18：出口葡萄酒中二硫代氨基甲酸酯残留量的测定顶空气相色谱法； SN/T4675.19：出口葡萄酒中钠、镁、钾、钙、铬、锰、铁、铜、锌、砷、硒、银、镉、铅的测定； SN/T4675.20：出口葡萄酒中稀土元素的测定电感耦合等离子体质谱法； SN/T4675.21：出口葡萄酒中可溶性无机盐的测定离子色谱法； SN/T4675.22：出口葡萄酒中总二氧化硫的测定比色法； SN/T4675.23：出口葡萄酒及葡萄汁中氨氮的测定连续流动分析仪法； SN/T4675.24：出口葡萄酒福林-肖卡指数的测定分光光度计法； SN/T4675.25：出口葡萄酒颜色的测定CIE1976（L*a*b*）色空间法； SN/T4675.26：出口葡萄酒浊度的测定散射光法； SN/T4675.27：出口葡萄酒碱性灰分的测定； SN/T4675.28：出口葡萄酒细菌、霉菌及酵母的计数； SN/T4675.29：出口葡萄酒中酒香酵母检验实时荧光PCR法： SN/T4675.30：出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验实时荧光PCR法。 本部分为SN/T4675的第29部分 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：刘夏、李晓虹、王传现、钱云开、李志勇、宋青、刘青、凌莉、张旺。 1 SN/T 4675.29—2016 出口葡萄酒中酒香酵母检验 实时荧光PCR法 1范围 SN/T4675的本部分规定了葡萄酒中酒香酵母（Brettanomycesbrurellensis）的定性检测方法。 本部分适用于各种葡萄酒中酒香酵母菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 酒香酵母 Brettanomyces bruxellensis 酒香酵母是一种可以存活于葡萄酒中的酵母菌，可以产生4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚等酚 类化合物，导致葡萄酒发出类似马汗的味道，如果浓度过高，会严重影响葡萄酒的品质。 4生物安全措施和防污染措施 4.1 生物安全措施 息服务平台 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照 GB19489中的有关规定执行。 4.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T27403的规定。 5 仪器和设备 5.1水浴锅或加热模板：95℃土5℃。 5.2高速冷冻离心机：最高离心力不低于12000g。 5.37 离心管：50mL、2mL。 5.4 移液器：量程0.5μL~10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL及无菌吸头。 1 SN/T 4675.29—2016 5.5 5无菌吸管，10.0mL（具0.1mL刻度）或移液器及吸头 5.6 计时器。 5.7 细胞破碎玻璃珠：直径500μm。 5.8 3涡旋振荡器。 5.9恒温干燥箱：48℃±1℃。 5.10 冰箱：一20℃±1℃。 5.11 荧光PCR仪。 5.12 无DnasePCR反应板或反应管。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.2 2Tris-HCl缓冲液：10mmol/L.pH8.0,见A.1。 6.3交联聚乙烯吡咯烷酮：Crosslinkingpolyvingypyrrolidone，缩略语为PVPP，360kDa。 6.4TE溶液：见A.2。 6.5溶液I:见A.3。 6.6抽提液：见A.4，4℃保存。 6.7醋酸铵溶液：4mol/L。 6.8RnaseA溶液：1μg/μL,4℃保存。 6.9 引物和探针：见表1。 表1 引物和探针序列 目标基因 引物序列 探针序列 F5'-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3" 酒香酵母RAD4 5'-FAM-ATGGCGAGGATGAAAG 蛋白编码基因 R 5′-TGCCAACTGCCGAATGTTCTC-3' TTTGGGATACA-BHQ1-3' 6.10 酒香酵母质控菌株：NBRC0628，或等效菌株。 示准信息服务平台 6.11 YM培养基：见A.5。 6.12 TaqDNA聚合酶。 6.13 dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP 6.14 10×PCR缓冲液。 6.15 MgCl,溶液：25mmol/L。 7操作步骤 7.1样品处理 取45mL待分析葡萄酒样品，置于具有无菌螺旋塞的50mL试管中，在4℃离心5min，离心力为 9300g，弃去上清液。然后加人45mL10mmol/LTris-HClpH8.0洗涤残渣，涡旋振荡上述溶液，在 4℃离心5min，离心力为9300g，弃去上清液。轻微涡旋，使沉淀悬浮于残留液体中。 2