SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.12—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第12部分：哈茨木霉 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection—Part 12:Trichoderma harzianum 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.12—2016 前言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第12部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、吉林出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：张莹、刘阳、裴程程、张震宇、吴洁元、杨曼慧、王芳。 标准信息服务平台 1 SN/T 4624.12—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第12部分：哈茨木霉 1范围 SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验哈茨木霉的形态学鉴定、实时荧光 PCR检测方法。 本部分适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验哈茨木霉检测和鉴定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 主要试剂和培养基 3.1 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）：见附录A中A.1。 3.3 马铃薯-葡萄糖液体培养基：见A.2。 3.4 CTAB缓冲液：见A.3。 3.5 蛋白酶K。 Tris饱和苯酚。 3.6 行业标准信息服务平台 3.7 三氯甲烷。 3.8 异戊醇。 3.9 异丙醇。 3.10 TE缓冲液（pH8.0）：见A. 3.11 70%乙醇。 3.12 溴化乙锭。 3.13 DNA分子量标记：1000bpDNAladder 3.14琼脂糖。 3.15 50×TAE缓冲液（pH8.5）：见A.5 3.16 RealMasterMix（2.5X，含ROX内参染料）。 3.17 20XProbe Enhancer Solution。 3.18液氮。 4主要设备和材料 电子天平（感量0.01g）。 4.2恒温培养箱：25℃土1℃。 1 SN/T4624.12—2016 4.3 恒温振荡器：25℃土1℃。 4.4恒温水浴锅。 4.5 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 4.6 PCR超净工作台。 4.7实时荧光PCR仪。 4.8 3微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 4.9 高压灭菌锅。 4.10电泳仪装置。 4.11 核酸/蛋白分析仪。 4.12 凝胶成像系统。 4.13 陶瓷研钵。 4.14 无菌培养皿：直径90mm。 4.15 灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。 4.16 接种棒、镍铬丝。 4.17 Eppendorf管和PCR反应管。 4.18 显微镜：物镜10×~100×。 5样品制备 5.1以无菌操作取1g（mL)样品加人到100mL无菌水中混匀，移取1环菌液连续划线接种5个PDA 平板，25℃土1℃条件下培养3d～5d取样过程中，在样品旁边放置1个PDA平板作为空白对照 5.2挑取单菌落划线接种在PDA平板上，25℃土1℃条件下培养3d～5d，得到纯化的菌株，进行形 态学鉴定。 5.3挑取符合形态学特征单菌落转人马铃薯-葡萄糖液体培养基中，25℃士1℃条件下180r/min振荡 业标准信 培养5d~7d,获得菌丝体。 6形态学鉴定 6.1培养性状 哈茨木霉在PDA平板上生长迅速，25℃接种PDA培养3d，菌落生长直径可达8cm，平铺，气生 PDA培养基上孢子常呈同心圆状分布，且孢子聚集在一起形成产孢簇，分生孢子团浅黄绿色。产孢簇 为颗粒状或粉状，颜色起初水绿色，后迅速转为黑绿色。 6.2 形态特征 菌丝透明，菌丝壁光滑。分生孢子梗纤细透明，壁光滑，直或者波曲，宽2.0um～5.0μm，长度多数 较短，15um～100um，分枝多；分生孢子梗复杂分枝，下部分枝长，上部分枝较短，初级分枝几乎呈直 角，或稍微向顶方向弯曲，常2个～3个旋涡状排列，向基部逐渐变长，二次分枝复杂，2个～4个呈旋涡 状排列。瓶梗烧瓶形，多3个～5个簇生，末端瓶梗细长，（5μm～13μm）×（2.5μm～3.8μm）。分生 孢子近球形，浅绿色，光滑或稍粗糙，2.1μm~3.3μm。