SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4603—2016 出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌 常见致病基因检测方法多重PCR及 多重实时荧光PCR法 Detection of toxigenic gene of Vibrio parahaemolyticus in food and water for exportMutiplex PCR method and 行业标准信息服务平台 mutiplex real-time PCR method 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4603—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 将《美国FDA细菌学分析手册》第九章弧菌2004（Chapter9：Vibrio2004ofFDABacteriological 光PCR方法》引物序列组合在一起，构成多重PCR的体系。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫 局、上海交通大学、上海市临床检验中心、昆明市西山区疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈丽萍、刘忠民、张继伦、陈芸、张建华、史贤明、王大鹏、王庆忠、王珏、 行业标准信息服务平台 1 SN/T4603—2016 出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌 常见致病基因检测方法 多重PCR及 多重实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了产毒副溶血性弧菌多重PCR及多重实时荧光PCR检测方法。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 《美国FDA细菌学分析手册》第九章弧菌2004（Chapter9：Vibrio2004ofFDABacteriological Analytical Manual) 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 多重 PCR mutiplex PCR 在同一个反应体系中加入一对以上的引物.同时检测几个目标基因的PCR方法。 3.2 多重实时荧光PCRmutiplexreal-timePCR 服务平台 在同一个反应体系中加人一对以上的引物，同时检测几个目标基因的实时荧光PCR方法。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 tdh：耐热溶血毒素对应的基因（thermostabledirecthemolysin） tlh：不耐热溶血毒素对应的基因（thermolabilehemolysin） trh：耐热直接溶血毒素相关溶血毒素对应的基因（thermostablerelatedhemolysin） 1 SN/T 4603—2016 第一法多重PCR检测方法 5方法提要 在同一个PCR反应管中，同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh和trh致病基因，根据扩增条带（gy rase91bp;tdh269bp;trh485bp)的有无，判定样品中是否含有副溶血性弧菌及产毒副溶血性弧菌。 6试剂和耗材 除另有规定外，试剂为分析纯或化学试剂。实验室用水应符合GB/T6682规定的要求。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1PCR反应预混液，可选用商业试剂盒。 6.2细菌基因组DNA提纯试剂盒。 6.3琼脂糖：电泳纯。 6.4溴化乙锭（EB)：10g/L。 6.50.5×TBE缓冲液：Tris5.4g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH值=8.0）2mL，加蒸馏水 至1 000 mL 6.6 无DNA酶污染的灭菌石蜡油：4℃保存。 6.7 引物：引物序列及相关信息见表1。 表1 引物序列和产物长度 靶基因 引物序列 产物大小 5'-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-3 gyrase 91 bp 5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' 5'-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3" tdh 269bp 5-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3' 5'-TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT-3' trh 485bp 5'-CATAACAAACATATGCCCATTTCCG-3' 息服务平台 仪器和设备 7.1 PCR仪。 7.2 恒温培养箱。 7.3高 离心机：离心转速≥12000r/min。 7.4天平：感量0.01g。 7.5 高压灭菌器。 7.6恒温水浴锅。 7.7 pH计。 7.8 电泳分析系统。 2