SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4556—2016 鸭疫里默氏菌病检疫技术规范 Quarantineprotocol for the infection withRiemerella anatipestifer 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4556—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、福建省农业科学研究院畜牧兽医研究所 和中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑腾、程龙飞、张体银、黄瑜、唐寰宇、傅光华、王武军、施少华、高以明、陈红梅、 张志灯、万春和、白泉阳、傅秋玲、李宋钰。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4556—2016 鸭疫里默氏菌病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸭疫里默氏菌病的临床诊断、细菌分离和鉴定以及聚合酶链式反应鉴定技术。 本标准适用于鸭、火鸡和鹅的鸭疫里默氏菌病临床诊断和实验室诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 3临床诊断 3.1 发病症状 当鸭、火鸡、鹅出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：咳嗽打喷嚏，流眼泪；眼鼻 分泌物增多，眼眶周围羽毛粘连，鼻内流出浆液性或粘液性分泌物，分泌物凝固后堵塞鼻孔后引起呼吸 困难；粪便白色、粘稠；表现神经症状如头颈震颤、转圈、不停地点头或摇头、后躯下坠、站立不稳、两肢呈 划水状、角弓反张、抽搐等。其他参见附录A。 3.2病理变化 当鸭、火鸡、鹅出现以下肉眼可见的病变时，可作为初步诊断的依据之一：心包外膜增厚，表面覆盖 一层白色或淡黄色的渗出物心包与胸骨粘连；肝脏表面覆盖一层灰白色或淡黄色易剥离的假膜；气囊 准信息服务平台 表面有灰白色或淡黄色干酪样物沉积。 实验室诊断 4.1设备 4.1.1 二氧化碳培养箱。 4.1.2光学显微镜。 4.1.3 培养箱（37±1)℃。 4.1.4 打孔器。 4.1.5 独立送风隔离笼具(IVC)。 4.1.6 水浴锅。 4.1.7 高速离心机。 4.1.8 微量可调移液器。 4.1.9 PCR仪。 1 SN/T 4556—2016 4.1.10 电泳仪。 4.1.11 紫外凝胶成像系统。 4.2 2材料和试剂 4.2.1 含2%新生牛血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板（TSA），配制方法见B.1。 4.2.2 含2%新生牛血清的胰蛋白陈大豆肉汤（TSB)，配制方法见B.2。 4.2.3 结晶紫染色液，配制方法见B.3。 4.2.4 革兰氏碘液，配制方法见B.4。 4.2.5 沙黄复染液，配制方法见B.5 4.2.6 鸭疫里默氏菌病平板凝集阳性血清，由指定单位提供。 4.2.7 鸭疫里默氏菌病平板凝集阴性血清，由指定单位提供。 4.2.8 高盐磷酸盐缓冲液，配制方法见B.6。 4.2.9 高盐琼脂平板，配制方法见B.7。 4.2.10 鸭疫里默氏菌病琼脂扩散阳性血清，由指定单位提供。 4.2.11 鸭疫里默氏菌病琼脂扩散阴性血清，由指定单位提供。 4.2.12 水：应符合GB/T6682所规定的一级水要求。 4.2.13 消化缓冲液，配制方法见B.8。 4.2.14 蛋白酶K。 4.2.15 Tris饱和酚。 4.2.16 三氯甲烷。 4.2.17 异戊醇。 4.2.18 无水乙醇。 4.2.19 Taq DNA 聚合酶。 4.2.20 脱氧核苷酸三磷酸dNTPs（含dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 4.2.21 引物（Primer）：10μmoL/L。根据鸭疫里默氏菌外膜蛋白A基因序列设计，扩增长度为 492 bp: 上游引物RATF5'-GAGCCAACTATTTGAGACACG-3' 下游引物RATR R5-CAACACAAGCATCGTCTTTAT-3' 琼脂糖（电泳纯）。 4.2.22 4.2.23 TAE电泳缓冲液，配制方法见B.9。 4.2.24 上样缓冲液，配制方法见B.10。 4.2.25 4.2.26 DNA纯化回收试剂盒。 4.2.27 DNA提取和PCR扩增可以采用等效的提取方法或试剂盒。 4.2.28 鸭疫里默氏菌标准菌株，可从中国兽医微生物菌种保藏管理中心购买（菌种保藏编号为SWUN 0983)。 4.3 细菌的分离和初步鉴定 4.3.1 样品采集 出现临床症状和病理变化的濒死鸭（火鸡、鹅）或死亡后不久鸭（火鸡、鹅），无菌采集肝脏、脑或心 血，采集时用烧红的刀片烧烙组织，而后用无菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心血内取样 2