2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 西 葫 芦 品 种 真 实 性 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 3 8 — 2 0 2 5 Z u c c h i n i ( C u c u r b i t a p e p o L . ) v a r i e t y g e n u i n e n e s s i d e n t i f i c a t i o n — S S R b a s e d m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９３８—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:北京市农林科学院蔬菜研究所、全国农业技术推广服务中心、北京蔬菜学会. 本文件主要起草人:张建、刘丰泽、金石桥、温常龙、李海真、杨静静、徐秀兰、夏昌选、邱艳红、王红阳、 俞新华、张国裕、张帆、田佳星. ⅠNY/T４９３８—２０２５ 西葫芦品种真实性鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用SSR分子标记法进行西葫芦(CucurbitapepoL􀆰)品种真实性鉴定的原理和总则、 鉴定程序、结果表示等. 本文件适用于西葫芦常规种和杂交种的品种真实性身份验证、真实性身份鉴定,也适用于品种关 系鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　第１部分:总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T３５４３􀆰１１　农作物种子检验规程　第１１部分:品种质量　品种真实性鉴定 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 品种真实性身份验证　varietyverification 经与其对应品种名称的标准样品比较,鉴定供检样品标注的品种名称是否真实. ３􀆰２ 品种真实性身份鉴定　varietyidentification 经与标准品种指纹数据比对平台筛查比较,鉴定供检样品的品种真实名称或与其他品种的同一性. ３􀆰３ 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品. ３􀆰４ 参照样品　referencecontrolsample 用于校准待测样品等位变异且已定义基因型的样品. ３􀆰５ 引物组合　primerpanel 具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记 引物. ３􀆰６ SSR指纹数据比对平台　SSRfingerprintblastplatform 采用SSR分子标记的规定位点组合鉴定品种标准样品等位变异的信息,运用数据库和网络信息技术 所构建的品种分子数据信息的检索比对载体. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. １NY/T４９３８—２０２５ bp:碱基对(basepair) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧBorateＧEDTA) Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] ５　原理和总则 ５􀆰１　原理 西葫芦不同品种基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)差异,这种差异可通过从有 代表性的混合试样或个体试样中提取DNA,采用SSR位点组合进行扩增,检测其扩增产物加以区分,通 过分析样品间DNA位点差异鉴定品种真实性. 注:DNA提取、PCR扩增、电泳、银染的溶液参照附录A配制,所用试剂均为分析纯. ５􀆰２　总则 ５􀆰２􀆰１　样品状况、引物、检测平台不同,其检测结果准确度、精确度可能有所不同.应依据“适于检测目 的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的样品数量、引物、检测平台,制订相应的检测方案. ５􀆰２􀆰２　首先选择附录B中前１６对引物进行检测,当样品间检测出的差异位点数小于３时,再选用附录B 中后１６对引物进行检测;必要时,进一步选择特定标记进行检测. ５􀆰２􀆰３　本文件推荐了变性PAGE垂直板电泳和毛细管电泳２个检测平台.对于品种真实性身份验证, 可选择采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳,送验样品和标准样品在同一块电泳板上比较.对于 真实性身份鉴定,宜采用毛细管电泳.如利用SSR指纹数据比对平台,可利用参照样品确定送验样品的 指纹后再进行真实性身份鉴定. ６　试验条件 真实性鉴定应在有利于检测正确实施的控制条件下进行,包括但不限于下列条件: a)　检验人员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能; b)所用仪器与使用的技术相适应,并已经过定期维护、验证和校准; c)使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材; d)使用经校准检测评定的参照样品. ７　试剂 ７􀆰１　DNA提取 ７􀆰１􀆰１　液氮(N２). ７􀆰１􀆰２　SDS(C１２H２５NaSO４,CAS号:１５１Ｇ２１Ｇ３). ７􀆰１􀆰３　氯化钠(NaCl,CAS号:７６４７Ｇ１４Ｇ５). ７􀆰１􀆰４　乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２􀅰２H２O,C１０H１４N２Na２O８,CAS号:６３８１Ｇ９２Ｇ６). ７􀆰１􀆰５　三羟甲基氨基甲烷(Tris,NH２C(CH２OH)３,CAS号:７７Ｇ８６Ｇ１). ７􀆰１􀆰６　无水乙醇(CH３CH２OH,CAS号:６４Ｇ１７Ｇ５). ７􀆰１􀆰７　盐酸(HCl,CAS号:７６４７Ｇ０１Ｇ０). ７􀆰１􀆰８　氢氧化钠(NaOH,CAS号:１３１０Ｇ７３Ｇ２). ２NY/T４９３８—２０２５ ７􀆰１􀆰９　异丙醇(C３H８O,CAS号:６７Ｇ６３Ｇ０). ７􀆰１􀆰１０　醋酸钾(C２H３KO２,CAS号:１２７Ｇ０８Ｇ２). ７􀆰２　PCR扩增 ７􀆰２􀆰１　dNTPs. ７􀆰２􀆰２　１０×PCRBuffer(含MgCl２). ７􀆰２􀆰３　Taq酶. ７􀆰２􀆰４　２×TaqMix. ７􀆰３　电泳 ７􀆰３􀆰１　变性PAGE垂直板 ７􀆰３􀆰１􀆰１　丙烯酰胺(C３H５NO,CAS号:７９Ｇ０６Ｇ１). ７􀆰３􀆰１􀆰２　N,NＧ亚甲基双丙烯酰胺(C７H１０N２O２,CAS号:１１０Ｇ２６Ｇ９). ７􀆰３􀆰１􀆰３　尿素(CH４N２O,CAS号:５７Ｇ１３Ｇ６). ７􀆰３􀆰１􀆰４　去离子甲酰胺(CH３NO,CAS号:７５Ｇ１２Ｇ７). ７􀆰３􀆰１􀆰５　乙二胺四乙酸(EDTA,C１０H１４N２O８,CAS号:６０Ｇ００Ｇ４). ７􀆰３􀆰１􀆰６　溴酚蓝(C１９H１０Br４O５S,CAS号:１１５Ｇ３９Ｇ９). ７􀆰３􀆰１􀆰７　二甲苯青(C２５H２７N２NaO７S２,CAS号:４４６３Ｇ４４Ｇ９). ７􀆰３􀆰１􀆰８　三羟甲基氨基甲烷(C４H１１NO３,CAS号:７７Ｇ８６Ｇ１). ７􀆰３􀆰１􀆰９　硼酸(BH３O,CAS号:１００４３Ｇ３５Ｇ３). ７􀆰３􀆰１􀆰１０　无水乙醇(C２H６O,CAS号:６４Ｇ１７Ｇ５). ７􀆰３􀆰１􀆰１１　亲和硅烷(bindingsilane). ７􀆰３􀆰１􀆰１２　剥离硅烷(repelsilane). ７􀆰３􀆰１􀆰１３　过硫酸铵(APS,H８N２O８S２,CAS号:７７２７Ｇ５４Ｇ０). ７􀆰３􀆰１􀆰１４　冰醋酸(Aceticacid)(C２H４O２,CAS号:６４Ｇ１９Ｇ７). ７􀆰３􀆰１􀆰１５　四甲基乙二胺(TEMED,C６H１６N２,CAS号:１１０Ｇ１８Ｇ９). ７􀆰３􀆰１􀆰１６　硝酸银(AgNO３,CAS号:７７６１Ｇ８８Ｇ８). ７􀆰３􀆰１􀆰１７　氢氧化钠(NaOH,CAS号:１３１０Ｇ７３Ｇ２). ７􀆰３􀆰１􀆰１８　乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２􀅰２H２O,C１０H１４N２Na２O８,CAS号:６３８１Ｇ９２Ｇ６). ７􀆰３􀆰１􀆰１９　甲醛(CH２O,CAS号:５０Ｇ００Ｇ０). ７􀆰３􀆰１􀆰２０　DNA分子量标准. ７􀆰３􀆰２　毛细管电泳 与使用的毛细管电泳仪型号相匹配的分离胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液等. ８　仪器设备 ８􀆰１　高速冷冻离心机:转速≥１２０００r/min. ８􀆰２　微量移液器或微量移液工作站. ８􀆰３　水浴锅或干式恒温金属浴:２０℃~６５℃. ８􀆰４　紫外分光光度计:波长定点扫描２３０nm、２６０nm和２８０nm. ８􀆰５　组织研磨仪.