2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 玉 米 品 种 及 其 实 质 性 派 生 品 种 鉴 定 S N P 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 1 1 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f m a i z e ( Z e a m a y s L . ) v a r i e t i e s a n d i t s e s s e n t i a l l y d e r i v e d v a r i e t i e s — S N P m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９１１—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　核心位点相关信息 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　检测平台的选择 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果计算 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １２　结果判定与表述 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　SNP位点名单及相关信息 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４９１１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起 草. 本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:北京市农林科学院玉米研究所、农业农村部科技发展中心. 本文件主要起草人:王凤格、田红丽、易红梅、赵久然、韩瑞玺、张秀杰、杨扬、王蕊、范亚明、葛建镕、赵 怡锟. ⅡNY/T４９１１—２０２５ 　 　 　玉米品种及其实质性派生品种鉴定　SNP标记法 １　范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性(SNP)标记进行玉米(ZeamaysL􀆰)品种及其实质性派生品种鉴 定的原理、主要仪器设备和试剂溶液配制、核心位点相关信息、检测平台的选择、操作程序、结果计算、结果 判定与表述. 本文件适用于玉米品种鉴定及其实质性派生品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T１９５５７􀆰２４　植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南　玉米 NY/T２５９４　植物品种鉴定DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４和GB/T１９５５７􀆰２４界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 单核苷酸多态性　singlenucleotidepolymorphism,SNP 在基因组水平上单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性. ３􀆰２ 实质性派生品种　essentialderivedvariety,EDV 由原始品种实质性派生,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种,与原始品种有明显区 别,并且除派生引起的性状差异外,在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始 品种相同. ３􀆰３ 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物种子或DNA样品. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates). EDV:实质性派生品种(essentialderivedvariety). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SDS:十二烷基苯磺酸钠(sodiumdodecylsulfate). SNP:单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism). ５　原理 玉米品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的SNP标记位点.不同玉米品种间同一组SNP位点 １NY/T４９１１—２０２５ 可能存在差异,这种差异可通过芯片及生物信息学等方法进行检测,进而区分不同的品种. ６　主要仪器设备及试剂 见附录A. ７　溶液配制 见附录B.所用试剂均为分析纯.试剂配制所用水应符合GB/T６６８２规定的一级水的要求. ８　核心位点相关信息 遴选了５００００个SNP位点作为玉米品种及其实质性派生品种鉴定的核心位点,位点信息见附录C. ９　检测平台的选择 宜选择基于激光微刻SNP芯片分型的检测平台.其他能达到同样效果的方法和SNP分型平台也可 采用,所选择的其他分型方案在采用之前应通过技术验证. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送检样品可为种子、幼苗、叶片、果穗等组织或器官.样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的要求. 试验样品取不少于３０个个体的叶片或其他等效物进行混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 １０􀆰２􀆰１　CTAB法 取试样的幼苗或叶片约２００mg,置于２􀆰０mL离心管,加液氮充分研磨,或取种子充分磨碎后移入 ２􀆰０mL离心管.每管加入７００μL经６５℃预热的CTAB提取液,充分混合,６５℃水浴６０min.其间不 时多次轻缓颠倒混匀.每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(２４∶１)混合液,充分混合后静置１０min, １２０００r/min离心１５min至分相.吸取上清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠 倒混匀,－２０℃放置３０min后４℃、１２０００r/min离心１０min.弃上清液,加入７０％乙醇,旋转数次后离 心弃去乙醇溶液,并倒立于垫有滤纸的实验台上,室温放置１０min以上.加入１００μL超纯水或TE缓冲 液,充分溶解后备用. １０􀆰２􀆰２　SDS法 取试样的幼苗或叶片约２００mg,或取种子充分磨碎后移入２􀆰０mL离心管,加入１００μL氯仿后研磨, 再加入３００μLSDS提取液,混匀后在１００００r/min离心２min.吸取上清液,转移至预先装有３００μL异 丙醇和３００μL５mol/L氯化钠溶液的１􀆰５mL离心管中.待成团后,挑出DNA,经７０％乙醇洗涤后,加 入２００μLTE缓冲液,充分溶解后供备用. 注:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足基因分型平台检测要求的其他提取方法均适用.提取的DNA 在２６０nm与２８０nm处的吸光度比值介于１􀆰７~２􀆰０,在２６０nm与２３０nm的吸光度比值大于２􀆰０. １０􀆰３　SNP分型 １０􀆰３􀆰１　DNA扩增、片段化、沉淀 具体步骤如下: a)　变性:DNA模板８􀆰７μL,每孔加８􀆰７μL的变性试剂,室温放置１０min; b)中和:每孔加５６􀆰６μL中和试剂; c)扩增:每孔加１００􀆰１μL扩增试剂,３７℃杂交炉中孵育(２３±１)h; d)终止扩增反应:将样品板从３７℃杂交炉中取出,放入６５℃杂交炉,孵育２０min,然后放入３７℃ 杂交炉,孵育４５min; e)片段化:每孔加２４􀆰８μL片段化预混试剂,３７℃孵育３０min; ２NY/T４９１１—２０２５ f)片段化终止反应:每孔加８􀆰３μL终止液; g)沉淀:每孔加入３６５􀆰４μL沉淀混合液,－２０℃放置１６h~２４h; h)以上试剂用量为选用３８４制式芯片时的推荐用量