2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 甜 菜 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 0 6 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f b e e t v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９０６—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物名单及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　引物分组 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４９０６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:黑龙江大学、北京市农林科学院杂交小麦研究所、农业农村部科技发展中心、黑龙江 省种业技术服务中心. 本文件主要起草人:刘乃新、李宏博、吴则东、韩瑞玺、吴玉梅、周芹、兴旺、刘阳娜、屈平平、刘丽华、 张明明、庞斌双、张毅瑞、杨国航、李亚会. ⅡNY/T４９０６—２０２５ 　 　 　甜菜品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)进行甜菜(BetavulgarisL􀆰)品种鉴定的术语和定义、缩略 语、原理、主要仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与表述. 本文件适用于甜菜品种的DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate). bp:碱基对(basepair). CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphates). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase). TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA). TE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine). Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM]. ５　原理 甜菜基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR位点,不同甜菜品种在同一SSR位点的重复次数可能 存在差异,这种差异可利用DNA提取、PCR扩增及电泳等方法进行检测,进而通过一组SSR引物组合区 分不同的甜菜品种. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂应符合附录A的要求. １NY/T４９０６—２０２５ ７　溶液配制 溶液配制方法应符合附录B的要求. ８　引物信息及使用 引物名单及序列应符合附录C的要求,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 时选择普通引物;利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向引物５′端,推荐的荧 光标记见附录D.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品 不同时,停止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送检样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官.送检样品如为种子,质量应不低于５０g或不少于 １０００粒;如为幼苗、叶片等组织或器官,样品应至少来自５０个植株个体. 从送检样品中随机分取有代表性的试样,试样可采用混合样或单个个体进行检测,混合样试样应至少 含有２０个个体,单个个体试样应至少含有２０个个体. １０􀆰２　DNA提取 取混合样本约２００mg,置于２􀆰０mL圆底离心管中,液氮冷冻后充分研磨;每管加入７００μL预热到 ６５℃的CTAB提取液及１０μL的βＧ巯基乙醇,充分混合,６５℃水浴４５min~６０min,每隔１５min轻缓颠 倒混匀,水浴后每管加入７００μL的三氯甲烷和异戊醇混合液,轻缓混匀后静置１０min,１２０００r/min离心 １０min.吸取上清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠倒混匀,－２０℃放置 ３０min,DNA沉淀后１２０００r/min离心１０min.弃上清液,用体积分数为７０％的乙醇溶液洗涤２遍,弃 乙醇,通风橱风干,加入１００μL双蒸水或TE缓冲液充分溶解,检测DNA浓度和纯度,－２０℃保存备用. 注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本文件.DNA 溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１􀆰７~２􀆰０. 注２:三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为２４∶１. １０􀆰３　PCR扩增 １０􀆰３􀆰１　反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表１配制,可以依据试验条件调整. 表１　PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐反应体积,μL １０×PCRBuffer(含Mg２＋) １０× １× ２􀆰０ dNTPs １０mmol/L ０􀆰４mmol/mL ０􀆰８ Taq酶 ５U/μL ０􀆰０５U/μL ０􀆰２ 上游引物 １０μmol/L ０􀆰５μmol/L １􀆰０ 下游引物 １０μmol/L ０􀆰５μmol/L １􀆰０ 模板DNA ５０ng/μL ５ng/μL ２􀆰０ ddH２O — — １３􀆰０ 总体积 ２０􀆰０ １０􀆰３􀆰２　反应程序 推荐反应程序:９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,５８℃退火３０s,７２℃延伸４５s,共３５个循环; ２NY/T４９０６—２０２５ ７２℃延伸１０min,产物４℃保存. 反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而做适