SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4525.3—2016 出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法第3部分：副溶血性弧菌 Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food- Part 3:Vibrio parahemolyticus 行业标准信息服务平台 2016-06-28发布 2017-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4525.3—2016 前言 SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法》共分10个部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：金黄色葡萄球菌； 一 第3部分：副溶血性弧菌； 第4部分：霍乱弧菌； 第5部分：克罗诺杆菌； 一第6部分：化脓链球菌； 第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：致泻性大肠埃希氏菌； 第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌； 第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。 本部分为SN/T4525的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫 局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：曾静、付博、蒋原、薛峰、张琳。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4525.3—2016 出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法第3部分：副溶血性弧菌 1范围 SN/T4525的本部分规定了出口食品中副溶血性弧菌分子分型MLST检测方法。 本部分适用于出口食品中副溶血性弧菌的分子分型。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义、缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 管家基因house-keepinggenes 所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保 守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。 3.1.2 Taq DNA 酶Thermus aquaticus DNA polymerase 从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA：乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraacetic Acid) MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping） ST：序列型（SequenceType) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] 4原理 MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编 1 SN/T4525.3—2016 号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因 的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的 实验室间具有良好的可比性。 5试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的 要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。 5.2 Taq DNA酶。 5.3dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。 5.5 510XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。 5.6 琼脂糖凝胶。 5.7Gelred核酸染色剂。 5.86X溴酚蓝上样缓冲液 5.9分子量标记：10obpDNAmarker。 5.105XTBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）。使用时 稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。 5.11质控菌株：副溶血性弧菌ATCC17802或等效菌株。 6仪器和设备 6.1离心机。 6.2天平：量程2kg，感量0.1g 6.3 pH计。 行业标准信房 6.4涡旋振荡器。 6.5 PCR仪。 6.6电泳仪。 6.7凝胶成像仪。 6.8 基因测序仪。 6.9超净工作台。 6.10移液器：0.1μL~2.5μL、2μL~20μL、20μL~ 服务 7检测程序 根据副溶血性弧菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A），通过管家基因片 段的PCR扩增，再进行PCR产物的纯化和DNA序列双向测定，将所得到的副溶血性弧菌7个管家基 最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.warwick.ac.uk/mlst/）进行在线数据分析，得到的结 果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副溶血性弧菌分离株的序列型。 在确定ST基础上应用eBURST程序对菌株进行分析，构建系统遗传进化树（参见附录B）。 MLST的操作程序见图1。 2