ICS 11.220 CCS B 41 DB 63 青海省 地方标准 DB 63/T 2552—2026 牛病毒性腹泻监测技术 2026 - 05 - 07发布 2026 - 06 - 01实施 青海省市场监督管理局 发布 DB 63/T 2552— 2026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由青海省农牧业标准化技术委员会提出。 本文件由青海省农业农村厅归口。 本文件起草单位： 西宁市动物疫病预防控制中心、青海大学畜牧兽医科学院、中国农业科学院兰州 兽医研究所、宁夏农林科学院动物科学研究所。 本文件主要起草人：孟茹、李志、韩元、付永、高闪电、王淑琴、吴英、薛万朝、陈长江、潘兴业、 曾小玲、林元清、陈辅云、肖利成、柳清、桑巴、王鸿忠、彭毛卓玛、王建东、李秀英、吴鹏、李存梅、 索南达杰、严德青、张珍、谢冲、杜梅卓、马元莲、徐生瑞、严海龙、王军、党媛、普华才让、徐青、 周措吉、李亚榕。 本文件由青海省农业农村厅监督实施。 DB 63/T 2552— 2026 1 牛病毒性腹泻监测技术 1 范围 本文件规定了牛病毒性腹泻监测技术术语和定义、监测目的和对象、监测方式和结果处理、流行病 学调查、样品采集处理、临床诊断和检测、监测数据分析和监测档案管理等内容。 本文件适用于牛科动物牛病毒性腹泻的监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18637 牛病毒性腹泻 /黏膜病诊断技术规范 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 1129 牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛病毒性腹泻 牛病毒性腹泻（ Bovine Viral Diarrhea ，BVD）又称为牛病毒性腹泻 /黏膜病，是由牛病毒性腹泻 病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV) 感染引起牛的传染病。临床上以发热、黏膜糜烂溃疡、 腹泻、呼吸道症状、出血综合征、白细胞减少、妊娠母牛流产、产畸型胎等为主要特征。世界动物卫生 组织将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为三类动物疫病。 3.2 最小群体单位 进行牛病毒性腹泻监测时，能够独立代表某一特定群体特征的最小牛群单元。 3.3 病毒分型 基于BVDV-1 、BVDV-2、BVDV-3基因型特定基因序列差异，通过套式 RT-PCR或荧光定量RT-PCR 鉴定其 基因型。 3.4 持续感染牛 DB 63/T 2552— 2026 2 妊娠母牛在怀孕早期(约120 d前)感染BVDV后可导致病毒的垂直传播,从而感染胎牛,感染的胎牛出 生后存活下来的大部分犊牛都会发展成为持续感染牛（ PI牛）。PI牛是BVDV最主要的储存宿主和传播来 源。 4 监测目的和对象 4.1 监测目的 掌握并跟踪 BVD在牛群中的分布，识别 PI牛，评价其危害程度，判定其流行发展趋势。 4.2 监测对象 整个牛群或特定区域内的牛群，重点监测新生犊牛、繁殖牛群和引进牛只。 5 监测方式和结果处理 5.1 被动监测 以兽医技术人员或养殖场（户）的BVD 疑似病例报告为监测核心，所有疑似病例应检尽检，适用于 疫情早期预警和持续监控。 5.2 主动监测 5.2.1 季节性监测 在冬季或春季高发期，按照7.2 中的采样方式，每年至少进行一次牛群 BVD普查。 5.2.2 宿主群体分层监测 在季节性监测的基础上，对新生犊牛群体、后备牛及繁殖牛群、妊娠母牛群体、流产胎儿、新引进 牛等进行分群分层检测。 5.2.3 风险区域分级监测 近三年内频发或者暴发过 BVD的地区，或正在暴发疫情或实施净化计划地区，增加监测频率，每六 个月一次；其他地区按季节性监测执行；屠宰场监测，每年每个场随机抽检屠宰牛的肠系淋巴结、脾脏 各50份进行检测。 5.3 监测结果处理 除屠宰场外，BVDV抗原阳性牛应进行隔离，间隔 14 d～21 d进行第二次采样检测，若抗原检测结果 呈阳性，则判定为PI 牛，应淘汰。 6 流行病学调查 6.1 问卷调查 收集养殖场（户）基本信息，填写动物疫病流行病学最初调查单，见附录A 的图A.1。 6.2 现场调查 DB 63/T 2552— 2026 3 观察牛只健康状况，记录临床症状，填写动物疫病流行病学现场调查单，见附录A 的图A.2。组织采 样、检测、隔离、消毒、治疗及无害化处理等。 6.3 跟踪调查 填写动物疫病流行病学跟踪调查单，见附录A 的图A.3，建立调查档案。 7 样品采集处理 7.1 采样原则 按照NY/T 541执行。 7.2 采样方式 7.2.1 随机抽样 年龄、品种、饲养条件等相同或相似牛群中随机抽取样本，以单个牛只为最小群体单位的或者不超 过5头的，抽检率要求为100% ；以圈舍或栏为最小群体单位，不超过50头的抽检率为 30%；以养殖场区为 最小群体单位，不超过200头的抽检数量不低于 10%；200头以上最小抽检量不低于 20头。 7.2.2 分层抽样 将年龄、品种、饲养条件等相差较大牛群，根据牛群特征进行分层，在每层内随机采样，抽样比例 同7.2.1。 7.3 样品采集 无菌采集抗凝全血；血清、组织样品、鼻拭子、精液、牛奶样品的采集、保存、贮存和处理按 GB/T 18637 执行。新鲜粪便样品使用一次性粪便采集器或手套等采集，采集量为3 g～5 g，4℃保存和 运输。 8 临床诊断和检测 8.1 临床诊断 按照GB/T 18637 执行。 8.2 检测 8.2.1 抗原检测 对血清、全血、新鲜粪便样品、组织中的病毒抗原检测，按照 SN/T 1129执行，或采用市售牛病毒 性腹泻抗原检测试剂盒进行检测。 8.2.2 核酸检测 8.2.2.1 仪器设备 DB 63/T 2552— 2026 4 生物安全柜、冰箱、高速台式离心机（最高离心力不低于 12000 g）、单道微量移液器（ 2.5 μL、 10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）、涡旋混合振荡器、 PCR仪、荧光定量 PCR仪、核酸电泳系统、凝 胶成像仪等。 8.2.2.2 耗材 无核酸酶吸头(10 μL、200 μL、1000 μL)、 无核酸酶离心管 (1.5 mL)、PCR仪的配套反应管 （板） 、 荧光定量PCR 仪配套的反应管（板）。 8.2.2.3 试剂 a) 无核糖核酸酶（Ribonuclease-Free Water ，RNase）水、TRIzol（2℃～25℃）、氯仿（ 2℃～ 8℃）、异丙醇、 75%乙醇、DL2000 DNA Marker； b) RNA提取试剂盒、 RT-PCR试剂盒、荧光探针 RT-PCR试剂盒、预混型 Taq酶； c) 1×TAE电泳液、 1.0%琼脂糖凝胶及其使用注意事项见附录 B； d) 逆转录聚合酶链式反应（ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ，RT-PCR ）引 物及其反应液见附录 C； e) 套式RT-PCR引物及其反应液见附录 D； f) 荧光定量 RT-PCR引物、探针序列及其反应液见附录 E； g) 阴性对照为无 BVDV核酸的RNA； h) RT-PCR阳性对照可 从BVDV AV6 9株或其它毒株细胞培养物提取，也可委托生物公司将毒株 5'UTR区合成至含 T7启动子载体后利用 T7 RNA聚合酶转录获得。 8.2.2.4 核酸提取 为确保检测准确性，严格按照以下步骤进行 RNA提取。可选用市售总 RNA提取试剂盒，参照说明书执 行。实验操作应在生物安全柜中进行，并全程使用无RNase耗材及试剂： a) 在样本制备区，根据待检样品数量（ n）取无RNase离心管，编号； b) 在生物安全柜中，每管中加入 600 μL Trizol，分别加入 100 μL待检血清、抗凝血、处理的 组织或新鲜粪便混悬液离心后的上清，充分混匀后加入 200 μL氯仿，充分颠倒混匀； c) 于4℃、12000 g离心15 min，小心吸取上清至一新的无 RNase离心管中， 加入 0.5 mL异丙醇， 轻轻混匀， 4℃、12000 g离心10 min； d) 弃上清，加入 1 mL无RNase水配制的冰冷 75%乙醇充分洗涤沉淀； e) 4℃、7500 g离心5 min，弃上清，吸去残存的液体，室温风干 3 min； f) 加入适量（ 20 μL～25 μL）无RNase水溶解，直接用于检测 -80℃保存。 8.2.2.5 RT-PCR BVDV的RT-PCR检测应按照分区操作要求（反应液配制区、样本制备区及检测区）进行，具体步骤如 下： a) 引物序列、反应液配方见附录 C； b) 在反应混合物配置区进行反应液配制