2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 鱼 类 耳 石 锶 钙 定 量 测 定 电 子 探 针 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 9 4 6 2 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f s t r o n t i u m a n d c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s i n f i s h o t o l i t h — E l e c t r o n p r o b e m i c r o a n a l y s i s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T９４６２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会渔业资源分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１０)归口. 本文件起草单位:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心. 本文件主要起草人:杨健、姜涛、刘洪波、陈修报、朱亚华、薛竣仁、阎明军. ⅠSC/T９４６２—２０２５ 鱼类耳石锶钙定量测定　电子探针法 １　范围 本文件描述了电子探针法测定鱼类耳石锶钙元素含量及其比值的测定原理,给出了测定所需的试剂 和材料、仪器设备,规定了样品采集与保存、处理与检测步骤、检测数据处理以及质量控制的技术要求,描 述了对应的证实方法. 本文件适用于鱼类耳石的电子探针法锶钙元素的定量分析. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T１５０７４　电子探针定量分析方法通则 GB/T４９３０—２０２１　微束分析　电子探针显微分析　标准样品技术条件导则 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 耳石　otolith 鱼类内耳膜迷路内的钙化硬组织,主要成分为碳酸钙,分为矢耳石、星耳石和微耳石３对. ４　原理 采用具有一定能量并被会聚的电子束轰击经打磨、抛光处理的鱼类耳石样品表面,使耳石样品被照射 区表面元素组分激发出特征波长的X射线,通过谱仪对X射线进行分光,测量相应元素的特征X射线强 度,并使之与相同条件下标准品所测得的对应元素X射线强度进行比较,计算获得耳石样品被激发区的 对应元素含量值. ５　试剂和材料 ５􀆰１　去离子水:电阻率≥１０MΩ􀅰cm. ５􀆰２　无水乙醇(C２H６O):化学纯,５００mL. ５􀆰３　培养板:４８孔亚克力细胞培养板,带盖. ５􀆰４　环氧树脂黏合剂:分A剂(环氧树脂)和B剂(凝固剂),混合后室温凝固. ５􀆰５　硅胶模具:直径２cm,高３cm,圆柱形. ５􀆰６　环氧树脂:冷镶嵌型,１L. ５􀆰７　载玻片:厚度１􀆰２mm~１􀆰５mm. ５􀆰８　粗砂纸:５００目. ５􀆰９　细砂纸:２０００目. ５􀆰１０　抛光布:橡胶抛光布搭配抛光液使用. ５􀆰１１　抛光液:二氧化硅型抛光液,粒度０􀆰２５μm,４L. ５􀆰１２　标准品:按GB/T４９３０—２０２１的要求,选用钛酸锶标样分析耳石中的锶元素,碳酸钙标样分析耳石 中的钙元素. １SC/T９４６２—２０２５ ６　仪器设备 ６􀆰１　解剖工具:镊子、剪刀. ６􀆰２　烘箱:３０℃~４０℃恒温干燥. ６􀆰３　切割机:转速３００r/min,锯片厚度１mm~２mm. ６􀆰４　打磨机:搭配砂纸使用,转速５０r/min~２００r/min. ６􀆰５　金相显微镜:正置、总放大倍数５０倍~６００倍,配有透、反射光２种光源. ６􀆰６　抛光机:搭配抛光布和抛光液使用,转速１００r/min~３００r/min. ６􀆰７　超声清洗机:工作频率４０kHz. ６􀆰８　真空镀碳仪:真空度２×１０－４Pa,镀膜电流３６A. ６􀆰９　电子探针显微分析仪:能进行锶原子M层电子跃迁至L层产生的Lα特征X射线以及钙原子L层 电子跃迁至K层产生的Kα特征X射线测定,检测极限可达０􀆰０１wt％. ７　样品 ７􀆰１　鱼类样品运输与保存 鱼类样品以冷藏或酒精浸泡的方式运回实验室后,冷冻保存.期间不可使用福尔马林等对耳石有腐 蚀作用的试剂保存标本. ７􀆰２　耳石样品处理 按以下步骤进行: a)　使用解剖工具(６􀆰１)摘取鱼类耳石,用去离子水(５􀆰１)冲洗耳石３min~４min,去除黏液和包膜; 用无水乙醇(５􀆰２)浸泡清洗耳石表面１min~２min,去除有机质;镜检确保无残留有机质后,将耳 石移入４８孔培养板(５􀆰３),放入烘箱(６􀆰２)３５℃~３８℃干燥１０h~１５h. b)对于鲤科鱼类,按微耳石、星耳石、矢耳石的顺序选取,其他鱼类按矢耳石、微耳石、星耳石的顺序 选取待处理的耳石样品.如首选顺序耳石不可用(如破损或缺失),按可使用的其他２个耳石顺 序选取. c)使用环氧树脂黏合剂(５􀆰４)将耳石固定在硅胶模具(５􀆰５)底部,倒入环氧树脂(５􀆰６)进行包埋 固定. d)树脂凝固后,按耳石剖面(优先选择矢状面,其次为横截面)平行于载玻片的方向,用环氧树脂黏 合剂(５􀆰４)将树脂块黏贴并固定在载玻片上(５􀆰７),充分按压去除气泡和多余黏合剂,待粘合剂充 分凝固后,使用切割机(６􀆰３)切除多余树脂部分,使拟打磨截面包埋树脂与耳石之间的厚度达 １mm左右. e)使用打磨机(６􀆰４)先后搭配粗砂纸(５􀆰８)、细砂纸(５􀆰９)打磨样品,至金相显微镜(６􀆰５)透射和反射 光光源下均能够清晰观察到耳石核心. f)使用抛光机(６􀆰６)搭配抛光布(５􀆰１０)和抛光液(５􀆰１１)对打磨好的样品进行抛光,利用金相显微镜 (６􀆰５)确认抛光至耳石核心,表面无明显划痕. g)使用超声清洗机(６􀆰７)清洗耳石样品５min后放入烘箱(６􀆰２)３５℃~３８℃烘干１２h以上. h)使用真空镀碳仪(６􀆰８)蒸镀碳膜后获得待测耳石样品,参考GB/T２８６３４—２０１２碳膜厚度控制在 ２０nm左右. ８　检测 ８􀆰１　检测步骤 按GB/T１５０７４规定的方法开展定量线分析,具体按以下步骤进行: a)电子探针显微分析仪(６􀆰９)开机预热３０min以上. b)用电子探针的二次电子像确定分析部位,调节焦距、对比度和亮度. ２SC/T９４６２—２０２５ c)耳石样品定量线分析前,测定相同条件下标准品(５􀆰１２)中锶元素、钙元素特征X射线强度和背 景强度. d)耳石样品定量线分析时,选择耳石剖面上自耳石核心至边缘最远半径轴上连续等距间隔点位进 行锶、钙元素含量分析;加速电压选择１５kV,探针电流选择２×１０－８A,驻留时间１５s/点;探针 直径视样品大小而定,对于仔稚鱼耳石样品宜使用２μm;耳石最远半径２mm以下的成鱼耳石 样品宜选用３μm,２mm及以上宜选用５μm;锶测量宜选用Lα线,钙测量宜选用Kα线. e)调用电子探针中ZAF氧化物定量校正程序来进行定量线分析结果的校正操作,并计算锶和钙元 素的氧化物含量. f)面分布分析时,分析区域选择耳石样品(７􀆰２)表面覆盖整个耳石剖面的最小矩形,加速电压同定 量线分析选择１５kV;探针电流选择５×１０－７A,驻留时间３０ms/点;探针直径仔稚鱼耳石宜选２ μm,成鱼耳石样品耳石最远半径２mm以下宜选用３μm;最远半径２mm及以上宜选用５μm; 面分布分析主要分析锶元素,测量宜选用Lα线. ８􀆰２　结果校正 参考GB/T３２０５５校正曲线法优化面分布结果,校正曲线按公式(１)计算,计算结果保留到小数点后 １位. C＝(I－B)/A (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: C———元素质量分数的数值,单位为质量百分数(wt％); I———X射线强度的数值,单位为每毫秒微安下所测X射线光子数[count/(ms􀅰μA)]; B———背底信号强度的数值,单位为每毫秒微安下所测X射线光子数[count/(ms􀅰μA)]; A———灵敏度的数值,单位为针对单位物质每毫秒微安下所测X射线光子数[count/(ms􀅰μA􀅰 wt％)]. ９　数据处理 将耳石样品中锶元素和钙元素氧化物结果转换为对应元素质量分数含量后计算耳石样品锶钙比 (RSr/Ca),锶钙比按公式(２)计算,计算结果保留到小数点后２位. RSr/Ca＝CSr/CCa×１０００ (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: RSr/Ca———锶钙比; CSr———耳石中所测锶(Sr)元素质量分数的数值,单位为质量百分数(wt％); CCa———耳石中所测钙(Ca)元素质量分数的数值,单位为质量百分数(wt％). １０　质量控制要求 最小检出限:锶元素０􀆰０１wt％,钙元素０􀆰０１wt％. 最小定量限:锶元素０􀆰０５wt％,钙元素０􀆰０１４wt％. 定量分析总量误差范围控制在±２％. ３SC/T９４６２—２０２５ 参　考　文　献 [１]　GB/T２８６３４—２０１２　微束分析　电子探针显微分析　块状试样波谱法定量点分析 [２]　GB/T３２０５５—２０１５　微束分析　电子探针显微分析　波谱法元素面分析 ４