2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 头 槽 绦 虫 病 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 5 1 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r S c h y z o c o t y l e a c h e i l o g n a t h i d i s e a s e S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 SC/T７２５１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站、中国水产科学研究院淡水渔 业研究中心. 本文件主要起草人:李文祥、王桂堂、张翔、郭传波、邹红、李明、习丙文. ⅠSC/T７２５１—２０２５ 头槽绦虫病诊断方法 １　范围 本文件描述了 头槽绦虫(Schyzocotyleacheilognathi)病诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、 样品,以及形态学鉴定、PCR检测和综合判定的方法. 本文件适用于 头槽绦虫病的诊断、监测和流行病学调查. ２　规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件. ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 寄生虫　parasite 寄生于水生动物的病原,包括原虫、蠕虫和甲壳类等. [来源:SC/T７０１１􀆰１—２０２１,３􀆰２􀆰４􀆰２] ３􀆰２ 寄生虫病　parasitosis 寄生虫侵入水生动物而引起的疾病. [来源:SC/T７０１１􀆰１—２０２１,３􀆰２􀆰４􀆰３] ３􀆰３ 绦虫病　cestodiasis 由绦虫侵入鱼体而引起的寄生虫病. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) rDNAＧITS:核糖体DNA的内转录间隔区(ribonsomalDNAＧinternaltranscribedspacer) TAE:TrisＧAcetateＧEDTA缓冲溶液 Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液(EDTATris􀅰HCl) TrisＧHCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸[Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride] ５　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅适用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水. ５􀆰１　无水乙醇:常温保存. ５􀆰２　二甲苯:常温保存. ５􀆰３　加拿大树胶:常温保存. １SC/T７２５１—２０２５ ５􀆰４　TaqDNA聚合酶:－２０℃保存,避免反复冻融. ５􀆰５　dNTPs(２􀆰５mmol/L):含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各２􀆰５mmol/L. ５􀆰６　上游引物:５′ＧGTCGTAACAAGGTTTCCGTAＧ３′; 下游引物:５′ＧTATGCTTAA(G/A)TTCAGCGGGTＧ３′. ５􀆰７　DNAmarker:２００bp~２０００bp,－２０℃保存. ５􀆰８　核酸染料:－２０℃保存. ５􀆰９　０􀆰７％生理盐水:按附录A中A􀆰１的要求配制. ５􀆰１０　４％甲醛溶液:按A􀆰２的要求配制. ５􀆰１１　高氏洋红液:按A􀆰３的要求配制. ５􀆰１２　裂解缓冲液:按A􀆰４的要求配制. ５􀆰１３　５０×TAE电泳缓冲液:按A􀆰５的要求配制. ５􀆰１４　１×TAE电泳缓冲液:按A􀆰６的要求配制. ５􀆰１５　DNA抽提缓冲液１:按A􀆰７的要求配制. ５􀆰１６　DNA抽提缓冲液２:按A􀆰８的要求配制. ５􀆰１７　TE缓冲液:按A􀆰９的要求配制. ５􀆰１８　琼脂糖凝胶(１％):按A􀆰１０的要求配制. ５􀆰１９　阴性对照:不含 头槽绦虫的鱼体组织DNA,－２０℃保存. ５􀆰２０　阳性对照: 头槽绦虫DNA,－２０℃保存. ６　仪器设备 ６􀆰１　体视显微镜. ６􀆰２　普通光学显微镜. ６􀆰３　高速冷冻离心机:最高转速１００００g以上,温度４℃. ６􀆰４　普通冰箱:具４℃冷藏室和－２０℃冷冻室. ６􀆰５　PCR扩增仪. ６􀆰６　水平电泳系统. ６􀆰７　凝胶成像系统. ７　临床症状 病鱼体色发黑,身体消瘦,食欲下降;典型症状是口常张开,病鱼拒食,腹部前端膨胀,剖开腹腔,可见 前肠有胃囊状凸起;剖检肠道可见乳白色的扁平带状虫体. ８　样品 ８􀆰１　采样对象 采集具有典型临床症状的鱼. ８􀆰２　采样数量 每一采样批次根据鱼的大小取１０尾~２０尾. ８􀆰３　鱼样品保存及运输 鱼样品宜活体运输到实验室,冰鲜样品４℃保藏,２４h内运输到实验室,立即取样检测. ８􀆰４　采样部位 剖开样品鱼的腹腔,剪取整个肠道. ８􀆰５　绦虫样品采集与保存 ２SC/T７２５１—２０２５ 用剪刀剪开肠壁,用镊子轻轻挑出虫体,避免拉断头部,放在盛有０􀆰７％生理盐水(５􀆰９)的培养皿中, 冲洗干净.一部分绦虫样品用于活体观察和标本制作,或用４％甲醛溶液(５􀆰１０)固定,２４h后,保存在 ８０％乙醇中. 另一部分绦虫样品用于分子鉴定,用无水乙醇固定,４℃保存. ９　形态学鉴定 ９􀆰１　绦虫标本制作 将８０％乙醇保存的绦虫样品进行复水,按照７０％乙醇→５０％乙醇→３０％乙醇→１０％乙醇→蒸馏水进 行,每一阶段约１５min;新鲜绦虫样品可直接进行染色. 将复水或新鲜的绦虫样品置于高氏洋红液(５􀆰１１)中,染色１０h后,用自来水冲洗２h. 脱水和透明按照１０％乙醇→３０％乙醇→５０％乙醇→７０％乙醇→８０％乙醇→９０％乙醇→９５％乙醇→ １００％乙醇→１００％乙醇→１００％乙醇＋二甲苯(１∶１)→二甲苯进行透明,每一阶段约１５min. 用镊子将透明后的虫体迅速放入载玻片上的加拿大树胶(５􀆰３)圆滴中,用解剖针将虫体标本拨正,盖 上盖玻片,干燥. ９􀆰２　形态学观察 将盛有生理盐水和新鲜绦虫样品的培养皿置于体视显微镜下(６􀆰１),调节放大倍数和焦距,观察绦虫 头节和体节形态. 染色标本则置于普通光学显微镜下(６􀆰２),观察头节形态,以及成熟节片的雌、雄性生殖器的位置、形 态、大小. ９􀆰３　结果判定 虫体扁带形,由多节片组成,头节略呈心形,两侧各有１个深沟槽(见附录B中的图B􀆰１).每个成熟 节片内精巢小球形,排列在髓部;卵黄腺散布在皮质部,比精巢小;卵巢双叶,横列在节片后端的中央处;子 宫呈S形,开口于节片中央腹面(见图B􀆰２). 如果虫体符合该形态学特征,判定形态学鉴定结果为阳性. １０　PCR检测 １０􀆰１　虫体DNA的提取与保存 将无水乙醇固定的绦虫剪取一个体节,充分干燥去除乙醇,置入１􀆰５mL的离心管中,加入５００μL裂 解缓冲液(５􀆰１２)于５５℃消化３h.冷却至室温后加入５００μLDNA抽提缓冲液１(５􀆰１５),冰上摇匀,静置 １０min;高速冷冻离心机(６􀆰３)１０００g,４℃离心１０min,收集上清液.再加入７００μLDNA抽提缓冲液 ２(５􀆰１６),冰上摇匀,静置１０min;１０００g,４℃离心１０min,取上清液. 然后加入２倍上清液体积的－２０℃预冷无水乙醇,４℃下１００００g离心１０min,弃上清液;７０％乙醇 洗涤沉淀２次,弃上清液,空气干燥后溶于４０μLTE缓冲液(５􀆰１７),－２０℃保存(６􀆰４). 虫体DNA提取也可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取试剂盒. １０􀆰２　rDNAＧITS的PCR扩增 ２５μL的PCR反应体系包括:１μL模板基因组DNA(１０ng~５０ng)、１μL的上游引物和１μL的下 游引物(１０μmol/L)(５􀆰６)、２μL的dNTPs(０􀆰２mmol/L)、２􀆰５μL的MgCl２(２mmol/L)、０􀆰５μL的Taq DNA聚合酶(５U/μL)(５􀆰４)和２􀆰５μLTaqDNA聚合酶缓冲液,最后加灭菌水１４􀆰５μL. PCR反应条件:９４℃预变性３min,再９４℃３０s→５６℃３０s→７２℃６０s,共３５个循环;７２℃延伸 １０min,最后４℃保温. PCR扩增时应设置阴性对照(５􀆰１９)和阳性对照(５􀆰２０). １０􀆰３　PCR产物电泳与测序 取５μLPCR产物,用１％琼脂糖凝胶(５􀆰１８)(含终浓度为０􀆰０５μL/mL核酸染料)于１×TAE电泳 缓冲溶液(５􀆰１４)中,在水平电泳系统(６􀆰６)５V/cm电压下电泳约０􀆰５h进行分离.同时,设置DNA ３SC/T７２５１—２０２５ marker(５􀆰７)作为参照,凝胶成像系统(６􀆰７)检查并拍照记录.如果观察到大约１４００bp大小扩增片段, 则对PCR扩增产物进行测序. １０􀆰４　结果判定 １０􀆰４􀆰１　检测成立的条件 阳性对照在１４００bp处有条带,阴性对照在１４００bp