2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 辣 椒 及 其 制 品 中 辣 椒 红 素 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法 2 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 8 0 . 2 0 C C S X 4 8 6 4 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f c a p s a n t h i n i n c h i l i a n d d e r i v e d p r o d u c t s — H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８６４—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部乡村产业发展司提出. 本文件由农业农村部农产品加工标准化技术委员会归口. 本文件起草单位:中国农业大学、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、晨光生物科技集 团股份有限公司、新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、河北晨光检测技术服务有限公司、昆 明理工大学、贵阳学院. 本文件主要起草人:廖小军、赵靓、王雪、劳菲、张晓芳、徐贞贞、朱靖蓉、杨雁、黄漩、周林燕、杨诗妮、 宋占腾、张楠、许粟. ⅠNY/T４８６４—２０２５ 辣椒及其制品中辣椒红素的测定　高效液相色谱法 １　范围 本文件规定了辣椒及其制品中辣椒红素的高效液相色谱检测方法. 本文件适用于鲜辣椒、剁辣椒、干辣椒及其辣椒红素提取物中辣椒红素含量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 辣椒及其制品中的辣椒红素经丙酮和无水乙醚提取,２０％氢氧化钾甲醇溶液皂化,用高效液相色谱 仪测定,外标法定量. ５　试剂和材料 ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　水:为符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰１􀆰２　氢氧化钾(KOH):分析纯. ５􀆰１􀆰３　甲醇(CH３OH):分析纯. ５􀆰１􀆰４　丙酮(CH３COCH３):分析纯. ５􀆰１􀆰５　丙酮(CH３COCH３):色谱纯. ５􀆰１􀆰６　无水乙醚(CH３CH２OCH２CH３):分析纯. ５􀆰２　溶液配制 ２０％氢氧化钾甲醇溶液:称取氢氧化钾(５􀆰１􀆰２)２００􀆰０g,加入２００mL水溶解,并用甲醇(５􀆰１􀆰３)定容 至１L. ５􀆰３　标准品 辣椒红素(C４０H５６O３,CAS号:４６５Ｇ４２Ｇ９):纯度≥９０％,或经国家认证并授予证书的标准物质或标准样 品. ５􀆰４　标准溶液配制 ５􀆰４􀆰１　辣椒红素标准储备溶液(１􀆰０mg/mL):按标准品证书提供的纯度换算后称量,用丙酮(５􀆰１􀆰５)定 容至１０mL,棕色样品瓶内冷冻避光储存,有效期２周. ５􀆰４􀆰２　辣椒红素标准工作溶液:准确移取一定量的标准储备溶液(５􀆰４􀆰１),用丙酮(５􀆰１􀆰５)稀释定容, 配制成浓度分别为０mg/L、１􀆰０mg/L、２􀆰０mg/L、５􀆰０mg/L、１０􀆰０mg/L、２０􀆰０mg/L、５０􀆰０mg/L的 标准工作溶液,现用现配. ５􀆰５　材料 有机系微孔滤膜:孔径为０􀆰４５μm. １NY/T４８６４—２０２５ ６　仪器与设备 ６􀆰１　高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器. ６􀆰２　分析天平:感量为０􀆰００００１g和０􀆰０１g. ６􀆰３　涡旋混合仪. ６􀆰４　离心机:转速不低于９０００r/min. ６􀆰５　氮吹仪. ６􀆰６　超声波清洗器. ６􀆰７　组织捣碎机. ６􀆰８　粉碎机. １　分析步骤 ７􀆰１　试样制备与保存 ７􀆰１􀆰１　鲜辣椒 取样品约３􀆰０kg,切碎混匀,四分法缩分至５００􀆰０g,匀浆后分装到洁净容器内密封作为试样,做好标 记,冷冻保存. ７􀆰１􀆰２　剁辣椒 取样品约２００􀆰０g,匀浆后分装到洁净容器内密封作为试样,做好标记,冷冻保存. ７􀆰１􀆰３　干辣椒 取样品约２００􀆰０g,粉碎或混匀后分装到洁净容器内密封作为试样,做好标记,阴凉通风处保存. ７􀆰１􀆰４　辣椒红素提取物 取样品约２００􀆰０g,混匀后分装到洁净容器内密封作为试样,做好标记,阴凉通风处保存. 注:辣椒红素提取物指以辣椒为原料,经过提取、分离、浓缩或干燥等过程,定向获取和浓集辣椒中的辣椒红素成分,一 般不改变其分子结构的产品. ７􀆰２　提取和皂化 ７􀆰２􀆰１　提取 称取试样(鲜辣椒５􀆰０g、剁辣椒５􀆰０g、干辣椒１􀆰０g或辣椒红素提取物１􀆰０g,精确至０􀆰０１g)于５０mL 离心管中;加入２０mL丙酮(５􀆰１􀆰４)和２０mL无水乙醚(５􀆰１􀆰６),涡旋混匀;超声２０min,９０００r/min离心 ５min,将上清液转移至２５０mL锥形瓶中.沉淀物重复提取１次,合并２次上清液;再向沉淀物中加入 １０mL丙酮(５􀆰１􀆰４)和１０mL无水乙醚(５􀆰１􀆰６),提取上清液,并与前２次上清液合并.平行做２份试验. ７􀆰２􀆰２　皂化 向上清液中加入２０％氢氧化钾甲醇溶液(５􀆰２)５０mL,摇匀后将溶液于室温放置１h(期间充分振荡 ２次~３次),将皂化液转移到分液漏斗中,并用水(５􀆰１􀆰１)进行多次洗涤,pH试纸测定,直至上层溶液呈 中性.收集上层皂化液于５０mL离心管中,待处理. ７􀆰２􀆰３　待测样品 将７􀆰２􀆰２中皂化液在低于３５℃下氮吹至近干,丙酮(５􀆰１􀆰４)定容至５mL,过０􀆰４５μm有机系微孔滤 膜得到待测样品. ７􀆰３　液相色谱参考条件 参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长２５０mm,内径４􀆰６mm,粒径５μm,或等效色谱柱; b)流动相A:丙酮(５􀆰１􀆰５); c)流动相B:水(５􀆰１􀆰１); d)柱温:３０℃; ２NY/T４８６４—２０２５ e)流速:１mL/min; f)进样量:１０μL; g)检测波长:４７４nm; h)洗脱条件应符合表１的要求. 表１　洗脱条件 时间 min流动相A ％流动相B ％ ０ ８０ ２０ ３ ８０ ２０ ６ ９０ １０ ８ １００ ０ １７ ８０ ２０ ２０ ８０ ２０ ７􀆰４　标准工作曲线绘制 按照７􀆰３设定的色谱工作条件,待仪器稳定后,测定标准工作溶液(５􀆰４􀆰２)中辣椒红素的色谱峰面积. 根据标准工作溶液(５􀆰４􀆰２)中辣椒红素的浓度和相应峰面积绘制辣椒红素的浓度色谱峰面积标准曲线, 标准品色谱图见附录A. ７􀆰５　试样溶液测定 将试样溶液按照７􀆰３设定的色谱工作条件进行测定,根据保留时间定性,根据标准曲线得到试样中辣 椒红素的含量.试样中辣椒红素含量超出工作曲线浓度时,用丙酮(５􀆰１􀆰４)稀释. ７􀆰６　空白试验 除不加试样外,均按照７􀆰２~７􀆰５测定步骤操作. ８　结果计算和表述 试样中辣椒红素含量按公式(１)计算. Xi＝(C－C０)×V×f m(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: Xi———试样中辣椒红素含量的数值,单位为毫克每千克(mg/kg); C———试样溶液中辣椒红素浓度的数值,单位为毫克每升(mg/L); C０———试剂空白中辣椒红素浓度的数值,单位为毫克每升(mg/L); V———提取液体积的数值,单位为升(L); f———试样溶液稀释倍数; m———试样质量的数值,单位为千克(kg). 测定结果用２次平行测定的算术平均值表示,计算结果保留３位有效数字. ９　精密度 在重复性条件下获得的２次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％. 在再现性条件下获得的２次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％. １０　检出限和定量限 当鲜辣椒和剁辣椒试样称样量为５􀆰０g,干辣椒和辣椒红素提取物称样量为１􀆰０g时,本文件辣椒及 其制品中辣椒红素的样品检出限和样品定量限见附录B. ３NY/T４８６４—２０２５ 附　录　A (资料性) 辣椒红素标准溶液色谱图 　 辣椒红素标准溶液(２０􀆰０mg/L)梯度洗脱条件下色谱图见图A􀆰１. 图A􀆰１　辣椒红素标准溶液(２０􀆰０mg/L)梯度洗脱条件下的色谱图 ４NY/T４８６４—２０２５ 附　录　B (资料性) 辣椒及其制品中辣椒红素的样品检出限和样品定量限 　 辣椒及其制品中辣椒红素的样品检出限和样品定量限见表B􀆰１. 表B􀆰１　辣椒及其制品中辣椒红素的样品检出限和样品定量限 样品名称 检出限,mg/kg 定量限,mg/kg 鲜辣椒 ０􀆰０１ ０􀆰０５ 剁辣椒 ０􀆰０１ ０􀆰０５ 干辣椒 ０􀆰０５ ０􀆰２５ 辣椒红素提取物 ０􀆰０５ ０􀆰２５ ５