2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 蜂 王 浆 及 其 冻 干 粉 中 蜂 王 浆 主 蛋 白 4 的 测 定 酶 联 免 疫 吸 附 法 4 7 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 4 0 C C S B 4 8 2 9 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f m a j o r r o y a l j e l l y p r o t e i n 4 i n r o y a l j e l l y a n d l y o p h i l i z e d r o y a l j e l l y p o w d e r — E n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８２９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC２７４)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院蜜蜂研究所、辽宁省农业发展服务中心、武汉市葆春蜂王浆有限责 任公司、浙江花谷源蜂业有限公司. 本文件主要起草人:胡菡、吕国达、赵文、王鹏、孟丽峰、冯毛、魏俏红、李建科、徐士磊、朱黎、刘春福、刘 西子. ⅠNY/T４８２９—２０２５ 蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白４的测定酶联免疫吸附法 １　范围 本文件描述了蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白４的酶联免疫吸附测定方法. 本文件适用于蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白４含量的测定. 本文件方法中蜂王浆主蛋白４在蜂王浆中的检出限为７mg/kg,定量限为６５mg/kg;在蜂王浆冻干 粉中的检出限为１４mg/kg,定量限为１３０mg/kg. 注:蜂王浆主蛋白４是蜂王浆主蛋白之一,其含量能够反映蜂王浆的新鲜度. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定蜂王浆主蛋白４的含量.样品中的蜂王浆主蛋白４与酶标板上 包被的特异性抗体结合,形成抗体抗原复合物;加入酶标抗体后形成抗体抗原抗体复合物;加底物显 色,酶标仪测定４５０nm处的吸光度值,根据吸光度值计算蜂王浆主蛋白４浓度,外标法定量.吸光度值 与样品中的蜂王浆主蛋白４含量成正比. ５　试剂或材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,三级. ５􀆰２　测定试剂盒中包含的试剂见附录A. ５􀆰３　蜂王浆主蛋白４对照品系列溶液配置:取１支蜂王浆主蛋白４对照品１００ng(A􀆰２),准确加入１mL 水充分溶解,得到１００ng/mL对照品溶液,然后依次用水倍比稀释成５０ng/mL、２５ng/mL、１２􀆰５ng/mL、 ６􀆰１２５ng/mL、０ng/mL的对照品系列溶液,临用现配. ５􀆰４　生物素标记抗体工作液:生物素标记抗体(A􀆰３)＋生物素标记抗体稀释液(A􀆰４)＝１＋９９,临用 现配. ５􀆰５　辣根过氧化物酶标记亲和素工作液:辣根过氧化物酶标记亲和素(A􀆰５)＋辣根过氧化物酶标记亲 和素稀释液(A􀆰６)＝１＋９９,临用现配. ５􀆰６　洗涤溶液:浓洗涤液(A􀆰７)＋水＝１＋２４,临用现配. ５􀆰７　空白试样溶液:空白试样采用水替代试样,并与试样同步进行试验. ５􀆰８　阳性质控溶液:取任一试样,根据其蜂王浆主蛋白４的含量选择一个合适的浓度进行添加,与试样同 步进行试验,以确定试验过程的操作准确性. ６　仪器设备 ６􀆰１　酶标仪:检测波长精度±２nm. １NY/T４８２９—２０２５ ６􀆰２　分析天平:精度为０􀆰００１g. ６􀆰３　冷冻离心机:转速不低于１２０００r/min. ６􀆰４　涡旋振荡器. ６􀆰５　单道和多道加样器. ６􀆰６　恒温培养箱:控温精度±１℃. ６􀆰７　超声波清洗仪. ７　样品 取蜂王浆２００g于密闭容器中,－１８℃储存不超过２个月;蜂王浆冻干粉２００g于密闭容器中,４℃以 下储存不超过２个月. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做两份试验.称取约１g蜂王浆或蜂王浆冻干粉试样(精确至０􀆰００１g)于５０mL离心管中,加水 ４０mL,室温下充分振荡２０min,或２０℃以下超声１０min,转移至１００mL容量瓶中.离心管用少量水洗 涤３次,洗液并入容量瓶中,并定容至１００mL(V),混匀.取适量溶液于４℃、１２０００r/min离心１５min, 上清液备用. ８􀆰２　稀释 ８􀆰２􀆰１　蜂王浆 准确移取１mL上清液(８􀆰１)于１００mL容量瓶中,用水稀释定容至１００mL(n,稀释１００倍),混匀,为 待测试样溶液. ８􀆰２􀆰２　蜂王浆冻干粉 准确移取１mL上清液(８􀆰１)于２００mL容量瓶中,用水稀释定容至２００mL(n,稀释２００倍),混匀,为 待测试样溶液. ８􀆰３　测定 注意:测定前包被好蜂王浆主蛋白４抗体的酶标板以及所有试剂和溶液均应回温至室温(２０℃±５℃). ８􀆰３􀆰１　在包被好蜂王浆主蛋白４抗体的微孔板中,依次加入１００μL蜂王浆主蛋白４对照品系列溶液 (５􀆰３)、空白试样溶液(５􀆰７)、阳性质控试样溶液(５􀆰８)和待测样品溶液(８􀆰２),覆上板贴,３６℃温育２h. ８􀆰３􀆰２　弃去孔内液体,在吸水纸上用力磕掉残留液体,不用洗涤. ８􀆰３􀆰３　每孔加入生物素标记抗体工作溶液(５􀆰４)１００μL,覆盖板贴,３６℃温育１h. ８􀆰３􀆰４　弃去孔内液体,每孔加入２００μL洗涤溶液(５􀆰６),浸泡２min,轻轻晃动后弃去溶液,在吸水纸上 用力磕掉残留液体,重复洗涤３次. ８􀆰３􀆰５　每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(５􀆰５)１００μL,覆上板贴,３６℃温育１h. ８􀆰３􀆰６　重复步骤８􀆰３􀆰４操作,重复洗涤５次. ８􀆰３􀆰７　依序向每孔加底物溶液(A􀆰８)９０μL,覆上板贴,３６℃避光显色１５min~２０min. ８􀆰３􀆰８　依序向每孔加入终止溶液(A􀆰９)５０μL终止反应,在５min内置酶标仪上,４５０nm波长读取各孔 溶液的吸光度值. 注:如上测定也可按照检测试剂盒说明书的操作步骤进行. ８􀆰４　标准曲线绘制 以蜂王浆主蛋白４对照品系列溶液质量浓度的对数(lg)为横坐标,以平均吸光度值为纵坐标绘制标 准曲线,相关系数不低于０􀆰９９.试样溶液中蜂王浆主蛋白４的浓度应在标准曲线的线性范围内.如果试 样中蜂王浆主蛋白４含量超出线性范围,则用水稀释(n倍),重新测定. ２NY/T４８２９—２０２５ ９　试验数据处理 蜂王浆及其冻干粉中蜂王浆主蛋白４的含量以质量分数w计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示.从 标准曲线上得到蜂王浆主蛋白４浓度(C)后,按公式(１)计算. W＝C×V×n m×１０００(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: C　———从标准工作曲线上得到的试样溶液中蜂王浆主蛋白４浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); V———待测试样溶液体积,单位为毫升(mL); n———试样稀释倍数; m———试样质量,单位为克(g); １０００———换算系数. 测定结果以平行测定的算术平均值表示,计算结果保留到小数点后两位. １０　精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过该算术平均值的２０％. ３NY/T４８２９—２０２５ 附　录　A (资料性) 蜂王浆主蛋白４测定试剂盒 　 A􀆰１　包被好蜂王浆主蛋白４抗体的９６孔酶标板. A􀆰２　蜂王浆主蛋白４对照品(纯度＞８０％):１００ng/支,冷冻保存. A􀆰３　生物素标记抗体. A􀆰４　生物素标记抗体稀释液. A􀆰５　辣根过氧化物酶标记亲和素. A􀆰６　辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液. A􀆰７　浓洗涤液. A􀆰８　底物溶液:注意避光保存. A􀆰９　终止液. A􀆰１０　板贴. ４