2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 根 瘤 固 氮 酶 活 性 的 测 定 气 相 色 谱 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 8 1 1 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f n i t r o g e n a s e a c t i v i t y f o r t h e r o o t n o d u l e — G a s c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８１１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部肥料标准化技术委员会提出并归口. 本文件起草单位:中国农业科学院油料作物研究所、全国农业技术推广服务中心. 本文件主要起草人:李培武、梁美娟、张良晓、张奇、汤松、蒋静怡、唐晓倩. ⅠNY/T４８１１—２０２５ 根瘤固氮酶活性的测定　气相色谱法 １　范围 本文件描述了气相色谱测定根瘤固氮酶活性的方法. 本文件适用于大豆、花生根瘤固氮酶活性的测定,其他豆科植物可参照执行. ２　规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件. ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 根瘤固氮酶活性　nitrogenaseactivityfortherootnodule 固氮酶催化空气中氮气还原为氨的能力. 注:根瘤固氮酶活性可以表示为单位质量的根瘤在单位时间内还原乙炔为乙烯的量,酶活性单位为μmol/(g􀅰h). ４　原理 本文件采用乙炔还原法测定固氮酶活性.根据固氮酶可还原乙炔等底物的特性,向含有根瘤的密闭 体系中加入乙炔,采用气相色谱仪分离检测,外标法定量,测定反应特定时间后产生的乙烯量表征固氮酶 活性. ５　试剂与材料 警示———使用高纯氢气、乙烯与乙炔时,防止易燃易爆. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　高纯氩气:纯度≥９９􀆰９９９％. ５􀆰１􀆰２　高纯氮气:纯度≥９９􀆰９９９％. ５􀆰１􀆰３　高纯氢气:纯度≥９９􀆰９９９％. ５􀆰１􀆰４　高纯空气:纯度≥９９􀆰９９９％. ５􀆰１􀆰５　乙烯气体(C２H４,CAS７４Ｇ８５Ｇ１４):纯度≥９９􀆰９９％,或经国家认证并授予标准物质证书的标准 物质. ５􀆰１􀆰６　乙炔气体(C２H２,CAS７４Ｇ８６Ｇ２):纯度≥９９􀆰９９％,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质. ５􀆰１􀆰７　常压乙烯气体制备:常温常压下,用气袋收集０􀆰５L乙烯气体(５􀆰１􀆰５),制备常压乙烯气体. ５􀆰１􀆰８　常压乙炔气体制备:常温常压下,用气袋收集０􀆰５L乙炔气体(５􀆰１􀆰６),制备常压乙炔气体. ６　仪器设备 ６􀆰１　气相色谱仪:配有氢火焰离子化检测器(FID). ６􀆰２　自动顶空进样器或相当于此功能的手动进样设备. ６􀆰３　分析天平:感量０􀆰０１g. ６􀆰４　恒温培养箱:温度范围要求(２８±２)℃. ６􀆰５　气密微量注射器:１０μL和２００μL. １NY/T４８１１—２０２５ ６􀆰６　顶空瓶:２０mL(配备铝盖和丁基橡胶或硅橡胶隔垫)和６０mL(配备聚丙烯瓶盖和硅胶四氟隔垫). ６􀆰７　一次性医用无菌注射器:５mL和１０mL. ６􀆰８　气袋:０􀆰５L. ７　样品 ７􀆰１　样品采集 取田间或盆栽整株样品,保持根系完整,低温运输至实验室. ７􀆰２　样品保存 样品送入实验室后宜尽可能当天进行测定.若不能当天测定,在４℃保存,保存期限不超过４８h. ７􀆰３　样品制备 用自来水洗净根系附着土壤,用吸水纸吸干水分,备用. ８　试验步骤 ８􀆰１　试样制备 从样品(７􀆰３)根上取下完整根瘤,称取１g根瘤(精确到０􀆰０１g)置于６０mL顶空瓶(６􀆰６)中,充高纯氩 气(５􀆰１􀆰１)５min排除顶空瓶内空气,立即盖紧瓶盖. ８􀆰２　酶活反应 用注射器(６􀆰７)从顶空瓶(８􀆰１)抽出６mL气体,再注入６mL乙炔气体(５􀆰１􀆰８).将其倒置于盛水的 烧杯中,水面高度不超过瓶身高度的１/４,置于２８℃恒温培养箱(６􀆰４)中反应２h. ８􀆰３　酶活测定 ８􀆰３􀆰１　顶空进样器参考条件: a)　恒温炉温度:３５℃; b)样品流路温度:４５℃; c)传输线温度:６５℃; d)样品瓶平衡时间:０􀆰１min; e)进样体积:１􀆰０mL; f)进样时间:０􀆰２min. ８􀆰３􀆰２　气相色谱仪参考条件: a)　色谱柱:键合聚苯乙烯二乙烯基苯毛细管色谱柱(３０m×０􀆰３２mm×２０μm),或性能相当者; b)载气:高纯氮气(５􀆰１􀆰２),流速２􀆰０mL/min; c)尾吹气:高纯氮气(５􀆰１􀆰２),流速２４􀆰０mL/min; d)燃气:高纯氢气(５􀆰１􀆰３),流速３２􀆰０mL/min; e)助燃气:高纯空气(５􀆰１􀆰４),流速２００􀆰０mL/min; f)色谱柱温度:起始温度５０℃,保持０􀆰３min,以５℃/min升温至６５℃,保持０􀆰２min; g)检测器温度:１６０℃; h)进样口温度:１２０℃; i)进样模式:分流进样,分流比１００∶１. ８􀆰４　标准工作曲线绘制 用气密微量注射器(６􀆰５)分别抽取１μL、５μL、１０μL、２０μL、５０μL、１００μL、１５０μL、２００μL常压乙烯气体 (５􀆰１􀆰７)稀释至充满高纯氩气(５􀆰１􀆰１)的２０mL顶空瓶(６􀆰６)中,上机分别测定.以乙烯体积(V)为横坐 标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线.乙烯与乙炔典型色谱图见附录A. ８􀆰５　样品测定 取出反应后的６０mL顶空瓶(８􀆰２),先用注射器(６􀆰７)从充满高纯氩气(５􀆰１􀆰１)的２０mL顶空瓶(６􀆰６) 中抽取５mL气体,再注入５mL反应后的气体(８􀆰２),放入顶空进样器,上机测定.依据乙烯峰面积,从标 ２NY/T４８１１—２０２５ 准工作曲线(８􀆰４)计算出乙烯体积(V). ８􀆰６　空白试验 除不加试样外,其余操作均按８􀆰１~８􀆰５的规定进行. ９　结果计算 ９􀆰１　乙烯物质的量 固氮酶催化乙炔还原过程中生成的乙烯物质的量按公式(１)计算. n＝V×１ ２２．４×２７３ (２７３＋T)×P ７６０􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: n　———固氮酶催化乙炔还原生成乙烯物质的量的数值,单位为微摩尔(μmol); V———固氮酶催化乙炔还原生成乙烯体积的数值,单位为微升(μL); ２２􀆰４———标准状态下气体摩尔体积的数值,单位为升每摩尔(L/mol); ２７３———绝对温度的数值,单位为开尔文(K); T———反应温度的数值,单位为摄氏度(℃); P———测定时所处实验室气压的数值,由气压表测定,单位为毫米汞柱(mmHg). ９􀆰２　固氮酶活性 固氮酶活性的数值按公式(２)计算. U＝n m×t×１２ (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: U———根瘤固氮酶活性的数值,单位为微摩尔每克每小时[μmol/(g􀅰h)]; n———固氮酶催化乙炔还原过程中生成乙烯物质的量的数值,单位微摩尔(μmol); m———根瘤鲜重的数值,单位为克(g); t———反应时间的数值,单位为小时(h); １２———稀释倍数的数值. 计算结果以重复性条件下获得的３次平行测定结果的算术平均值表示,计算结果表示到小数点后２位. １０　精密度 在重复性条件下,获得２次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的２５％. １１　其他 在本文件规定的条件下,根瘤固氮酶活性测定的检出限为０􀆰０５μmol/(g􀅰h),定量限为０􀆰２０μmol/(g􀅰h). ３NY/T４８１１—２０２５ 附　录　A (资料性) 乙烯与乙炔典型色谱图 　 乙烯(１００μL)与乙炔(１５０μL)典型色谱图见图A􀆰１. 图A􀆰１　乙烯(１００μL)与乙炔(１５０μL)典型色谱图. ４