2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 非 洲 菊 隐 地 疫 霉 检 测 实 时 荧 光 定 量 P C R 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 8 0 1 — 2 0 2 5 D e t e c t i o n o f P h y t o p h t h o r a c r y p t o g e a i n g e r b e r a — R e a l - t i m e f l u o r e s c e n t q u a n t i t a t i v e P C R m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８０１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:云南省农业科学院花卉研究所、全国农业技术推广服务中心、昆明市农业科学研 究院. 本文件主要起草人:王丽花、张颢、瞿素萍、杨秀梅、李绅崇、左文天、邱显钦、孙爱青、冯德党、黄望启、 苏艳、张艺萍、张丽芳、许凤. ⅠNY/T４８０１—２０２５ 非洲菊隐地疫霉检测　实时荧光定量PCR法 １　范围 本文件描述了非洲菊隐地疫霉(PhytophthoracryptogeaPethybr􀆰&Laff􀆰)实时荧光定量PCR检测 的原理、仪器和设备、试剂与耗材、样品制备与存放、试验步骤、结果判定及试验数据处理的技术要求. 本文件适用于非洲菊(GerberajamesoniiBolus)植株隐地疫霉的检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T３６２９—２０２０　马铃薯黑胫病和软腐病菌PCR检测方法 NY/T４４３０—２０２３　香石竹斑驳病毒的检测　荧光定量PCR法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ Ypt１基因　Rasrelatedprotein１gene 三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因,具有高度保守的外显子和多个高度可变的内含子,其基因序列保 守区和进化区相互间隔. ３􀆰２ TaqMan探针　TaqManprobe 一种检测寡核苷酸的荧光探针,其５′末端携带荧光基团(可选FAM、TET、VIC、HEX等),３′端携带 淬灭基团(如TAMRA、BHQ等). [来源:NY/T４４３０—２０２３,３􀆰２] ３􀆰３ 实时荧光定量聚合酶链式反应　realtimefluorescentquantitativePCR 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法. ３􀆰４ Ct值　cyclethresholdvalue 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数. ３􀆰５ 质粒标准品　plasmidreferencemolecule 一种包含目标靶基因的重组质粒分子,可用于病原菌等定性定量检测时的标准曲线构建. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid). Ypt１:三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Rasrelatedprotein１gene). dNTPs:脱氧核苷三磷酸混合液(deoxynucleosidetriphosphatemixture). １NY/T４８０１—２０２５ PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]. FAM:６羧基荧光素(６carboxyfluorescein). BHQ１:黑洞淬灭基团１(blackholequencher１). bp:碱基对(basepair). ５　原理 利用隐地疫霉菌(见附录A)Ypt１基因的高度保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,构建靶标 阳性重组质粒,建立标准曲线及相应线性方程,根据实时荧光PCR检测Ct值开展隐地疫霉菌的定性或定 量判定. ６　仪器和设备 ６􀆰１　实时荧光定量PCR仪. ６􀆰２　热循环仪. ６􀆰３　电泳仪. ６􀆰４　水平电泳槽. ６􀆰５　凝胶成像系统(波长３０２nm或３６５nm). ６􀆰６　超微量紫外可见光分光光度计(波长１９０nm~８４０nm). ６􀆰７　高速冷冻离心机:离心力１２０００g以上,工作温度－５℃~３０℃. ６􀆰８　高压灭菌锅. ６􀆰９　超低温冰箱:－８０℃. ６􀆰１０　冰箱:２℃~８℃,－２０℃~－１５℃. ６􀆰１１　微量移液器:量程分别为０􀆰１μL~２􀆰５μL,０􀆰５μL~１０μL,５μL~２０μL,１０μL~１００μL,２０μL~ ２００μL,１００μL~１０００μL. ６􀆰１２　电子天平:感量为０􀆰０１g. ６􀆰１３　生物安全柜:洁净度１００级以上. ６􀆰１４　超净工作台:洁净度１００级以上. ７　试剂与耗材 ７􀆰１　要求 除特别说明外,在检测中应使用分析纯或化学纯试剂,所有试剂均应用无RNA酶的容器分装;实验 用水应符合GB/T６６８２规定的二级水指标,其中涉及PCR扩增的用水为无RNA酶的ddH２O. ７􀆰２　引物及探针 引物及TaqMan探针序列见表１. 表１　引物探针序列 名称 序列(５′→３′) 产物长度,bp) 上游引物:P􀆰cryF 下游引物:P􀆰cryR P􀆰cryprobe５′GGACCAGGAGTCATTCAACAA３′ ５′GGCAATCACAACAAGCTACAC３′ ５′FAMCATACAACAATGAAGTTGAGTTCGCGCCBHQ１３′１２２ ７􀆰３　试剂 ７􀆰３􀆰１　市售商品化植物基因组DNA提取试剂盒. ７􀆰３􀆰２　dNTP混合物(浓度为２􀆰５mmol/L,pH７􀆰５). ２NY/T４８０１—２０２５ ７􀆰３􀆰３　TaqDNA聚合酶(５U/μL). ７􀆰３􀆰４　１０×PCR缓冲液(含Mg２＋). ７􀆰３􀆰５　１０×TAE电泳缓冲液. ７􀆰３􀆰６　GeneGreen核酸染料. ７􀆰３􀆰７　５００bpDNA分子量标准物. ７􀆰３􀆰８　１％琼脂糖凝胶. ７􀆰３􀆰９　实时荧光定量PCR扩增混合液 含有PremixExTaq聚合酶(５U/μL)、上游引物(２０μmol/L)、下游引物(２０μmol/L)、TaqMan探 针(１０μmol/L)、无RNA酶ddH２O及模板的混合液. ７􀆰４　耗材 DNA提取吸附柱及套管、实时荧光定量PCR专用８联管及管盖或９６孔板、各量程微量枪头 (２􀆰５μL、１０μL、２００μL、１０００μL). ８　样品制备与存放 ８􀆰１　取样和样品制备 样品流水冲洗干净后用灭菌滤纸吸干水分,植株取根颈部位组织,组培苗取全株,剪碎后置于一次性 自封袋中.设立阳性对照和空白对照,阳性对照为感染隐地疫霉的非洲菊样品,空白对照为无RNA酶的 ddH２O. ８􀆰２　样品存放 样品临时保存时置于２℃~８℃冰箱保存,保存时间不超过２４h;中长期保存时置于－８０℃的超低 温冰箱,保存时间不宜超过１年,保存过程中避免反复冻融. ８􀆰３　剩余样品处理 剩余样品或无需保存的样品及时做高压灭菌等无害化处理. ９　试验步骤 ９􀆰１　基因组DNA提取与质量判定 ９􀆰１􀆰１　基因组DNA提取 按NY/T３６２９—２０２０中６􀆰３的要求或市售商品化植物基因组DNA提取试剂盒方法提取基因组 DNA. ９􀆰１􀆰２　基因组DNA提取质量及浓度的判定 通过以下任一方法进行判定: a)　在超微量紫外可见光分光光度计上测定样品基因组DNA的光吸收值及浓度,当A２６０/A２８０比 值在１􀆰８~２􀆰０时,判定提取的DNA质量符合后续实时荧光定量PCR的扩增要求. b)通过电泳和凝胶成像系统观察条带的方法判定基因组DNA质量及浓度,电泳后仅出现一条亮 度高的条带,且上下无拖尾,点样孔内或附近无蛋白残留,判定提取的DNA质量好纯度高,符合 后续实时荧光定量PCR的扩增要求. ９􀆰２　实时荧光定量PCR检测 ９􀆰２􀆰１　对照设置 阳性对照:９􀆰１􀆰１提取的阳性样品DNA或含有经７􀆰２引物探针扩增的隐地疫霉Ypt１基因片段的重 组质粒DNA(见附录B),拷贝数为１×１０４个/μL. 空白对照:无RNA酶ddH２O. ９􀆰２􀆰２　反应液配制 在超净工作台或生物安全柜中取出实时荧光定量PCR反应所需试剂,冰上融化后,根据检测样品数 ３NY/T４８０１—２０２５ 量配制扩增反应液,反应液组分见表２. 表２　实时荧光定量PCR扩增反应混合液配制组分 试剂 使用量,μL ２５μL反应体系终浓度 PremixExTaq(２×)混合液 １２􀆰５ １× ２０μmol/LP􀆰cryF ０􀆰５ ０􀆰４μmol/L ２０μmol/LP􀆰cryR ０􀆰５ ０􀆰４μmol/L １０μmol/LP􀆰cryprobe １􀆰０ ０􀆰４μmol/L 提取的样品DNA模板或对照 ２􀆰０ 按９􀆰１􀆰２提取浓度计算,宜为２ng/μL~４ng/μL R