2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 玉 米 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 1 4 3 2 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f m a i z e （ Z e a m a y s L . ） v a r i e t i e s — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 ´úÌæ N Y / T 1 4 3 2 — 2 0 1 4NY/T１４３２—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　引物信息及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　参照品种及使用 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　主要仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(规范性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(规范性)　引物及序列 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　引物相关信息 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(资料性)　参照品种相关信息 １７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T１４３２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件代替NY/T１４３２—２０１４«玉米品种鉴定技术规程　SSR标记法»,与NY/T１４３２—２０１４相比, 除结构调整和编辑性改动外,主要技术内容变化如下: a)　更改了“样品准备”中送验样品和试验样品的表述(见１０􀆰１); b)更改了“判定规则”和“结果表述”(见１２􀆰１和１２􀆰２); c)增加了“引物荧光基团标记的位置”(见表C􀆰１); d)更改了位点umc１３３５、phi２９９８５２、umc１２３１的引物序列(见表C􀆰１); e)更改了部分引物扩增范围区间(见表C􀆰２); f)增加了部分引物扩增区间范围外的新增等位变异信息(见表C􀆰３); 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:北京市农林科学院玉米研究所、农业农村部科技发展中心、全国农业技术推广服务 中心、北京市种子管理站. 本文件主要起草人:王凤格、葛建镕、易红梅、赵久然、刘亚维、韩瑞玺、晋芳、吴明生、田红丽、任洁. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００７年首次发布为NY/T１４３２—２００７,２０１４年第一次修订; ———本次为第三次修订. ⅡNY/T１４３２—２０２５ 　 　 　玉米品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SSR)标记进行玉米(ZeamaysL􀆰)品种鉴定的原理、主要仪器设 备及试剂、溶液配制、引物信息及使用、参照品种及使用、操作程序、结果判定与表述. 本文件适用于玉米品种的DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APS:过硫酸铵(ammoniumpersulphate). bp:碱基对(basepair). CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide). DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid). dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates). EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid). PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis). PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction). SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate). SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat). Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqDNApolymerase). TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸(TrisＧborateＧEDTA). TE:三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisＧEDTA). TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N′,N′Ｇtetramethylethylenediamine). Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM]. ５　原理 玉米基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR位点,不同玉米品种在同一SSR位点的重复次数可能 存在差异,这种差异可通过提取玉米基因组DNA后,利用PCR扩增、电泳的方法进行检测,进而通过一 组SSR引物组合区分不同的玉米品种. ６　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. １NY/T１４３２—２０２５ ７　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ８　引物信息及使用 引物及序列见附录C,引物相关信息见附录D.利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时选择普通引物; 利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物,荧光标记位于正向或反向引物的５′端,推荐的荧光标记 见附录D.可利用附录C中的引物序贯检测,当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时, 停止检测. ９　参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异,宜与送检样品同时检测,参照品种相关信息 见附录E. １０　操作程序 １０􀆰１　样品准备 送验样品可为种子、幼苗、叶片、果穗、果皮等组织或器官.样品需扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的要 求.试验样品取不少于３０个个体的叶片或其他等效物,等量混合分析,必要时进行个体检测. １０􀆰２　DNA提取 １０􀆰２􀆰１　CTAB法 取试样的幼苗或叶片约２００mg,置于２􀆰０mL离心管,加液氮充分研磨,或取种子充分磨碎后移入 ２􀆰０mL离心管.每管加入７００μL经６５℃预热的CTAB提取液,充分混合,６５℃水浴６０min.其间不时 多次轻缓颠倒混匀.每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(２４∶１)混合液,充分混合后静置１０min, １２０００r/min离心１５min至分相.吸取上清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,轻轻颠 倒混匀,－２０℃放置３０min后４℃、１２０００r/min离心１０min.弃上清液,加入７０％乙醇,旋转数次后 离心弃去乙醇溶液,并倒立于垫有滤纸的实验台上,室温放置１０min以上.加入１００μL超纯水或TE缓 冲液１,充分溶解后供备用. １０􀆰２􀆰２　SDS法 剥取干种子的胚放入１􀆰５mL离心管,加入１００μL三氯甲烷后研磨,再加入３００μLSDS提取液,混 匀后在１００００r/min离心２min.吸取上清液,转移至预先装有３００μL异丙醇和３００μL５mol/L氯化 钠溶液的１􀆰５mL离心管中.待成团后,挑出DNA,经７０％乙醇洗涤后,加入２００μLTE缓冲液１,充分 溶解后供备用. １０􀆰２􀆰３　碱煮法 切取试样种子的胚或剪取１􀆰５cm长的幼苗