ICS11.220 B41T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ423—2025 对虾急性肝胰腺坏死病致病弧菌的检测 重组酶聚合酶扩增法 DetectionofVibriospp.causingacutehepatopancreaticnecrosisdiseaseinshrimp– recombinasepolymeraseamplification 2025-12-30发布 2026-01-30实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ423—2025 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：宁波大学、浙江省海洋水产养殖研究所、中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本文件主要起草人：周前进、陈炯、闫茂仓、董宣、王瑶华、黄贤克、冀德伟、陈琛、李明云。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ423—2025 1对虾急性肝胰腺坏死病致病弧菌的检测重组酶聚合酶扩增法 1范围 本文件描述了对虾急性肝胰腺坏死病（acutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND）致病 弧菌检测的样品采集、核酸检测、物种鉴定及综合判定的技术规程。 本文件适用于携带pirA和/或pirB毒力基因的副溶血弧菌、坎氏弧菌、欧文斯氏弧菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 GB/T28630.4—2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法 SC/T7011.1水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语 SC/T7011.2水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则 SC/T7233—2020急性肝胰腺坏死病诊断规程 SC/T9102.2渔业生态环境监测规范第2部分：海洋 3术语和定义 SC/T7011.2界定的术语和定义适用于本文件。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AHPND：急性肝胰腺坏死病（acutehepatopancreaticnecrosisdisease） BHQ1：黑洞淬灭基团（blackholequencher1） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） FAM：5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein） RPA：重组酶聚合酶扩增（recombinasepolymeraseamplification） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate） Tris·HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride） THF：四氢呋喃（tetrahydrofuran） VAHPND：致急性肝胰腺坏死病弧菌（AHPND-causingVibriospp.） VCAHPND：致急性肝胰腺坏死病坎氏弧菌（AHPND-causingVibriocampbellii） 全国团体标准信息平台 T/ZNZ423—2025 2VOAHPND：致急性肝胰腺坏死病欧文斯氏弧菌（AHPND-causingVibrioowensii） VPAHPND：致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（AHPND-causingVibrioparahaemolyticus） 5检测原理 应用荧光RPA技术，通过检测pirA和pirB毒力基因，判定样品中是否存在VAHPND。对VAHPND阳性样品，进 一步通过检测rpoD、toxR、rctB物种特异性基因，区分副溶血弧菌、坎氏弧菌和欧文斯氏弧菌。 6试剂和材料 6.1本文件中所有化学试剂，除非另有规定，均为分析纯试剂，应符合下列要求： a）实验用水符合GB/T6682要求的一级或二级水。 b）核酸提取试剂：参照附录B，或使用等效的商品化试剂盒。 c）RPA反应试剂：30ng/μLBsuDNA聚合酶、120ng/μLrecA重组酶、30ng/μLExoIII、90ng/ μL单链结合蛋白、1mmol/LdNTP、100mmol/LTricine、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶, 保存于200μL反应管中冻干。也可采用等效的商品试剂盒。 d）280mmol/L醋酸镁溶液。 e）10μmol/L上游引物、10μmol/L下游引物、10μmol/L探针。合成的引物经聚丙烯酰胺凝胶 电泳（PAGE）纯化或高效液相色谱（HPLC）纯化，探针经HPLC纯化。引物与探针序列见附录A。 6.2不含DNA的移液器吸头（10μL、200μL、1000μL）、不含DNA的离心管（1.5mL、2mL）。 7仪器与设备 7.1荧光检测仪：具有恒温扩增功能，39℃±1℃。 7.2高速离心机：能够降低至4℃，最大转速可达12000rpm 7.3天平：感量0.01g。 7.4恒温金属浴或水浴锅：100℃±1℃。 7.5低温冰箱：-20℃。 7.6控温摇床：-15℃～80℃，±0.1度；能满足转速180rpm～220rpm，振幅择20mm～25mm（回 旋式）。 8检测步骤 8.1样品采集 采样数量、采样方法、运输与保存应符合GB/T28630.4—2012附录B的要求。 组织样品具体按照SC/T7233—2020中第8.3.2条的规定进行采集。 水体样品按照SC/T9102.2的要求采集和保存。用无菌容器采集500mL,冷藏运输。或-20℃保存待 检。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ423—2025 38.2组织及粪样DNA提取 8.2.1取10mg～50mg组织样品或粪样，加入抽提缓冲液（附录B.1）500μL，充分研磨，37℃温浴 1h。 8.2.2加入2.5μL20g/L的蛋白酶K（附录B.2），充分混匀后50℃水浴3h，期间颠倒混匀数次。 8.2.3将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚（附录B.3），颠倒混匀10min，10000rpm离心5 min，分离水相和有机相。 8.2.4水相移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（体积比25:24:1），颠倒混匀10 min，10000rpm离心1min分离水相和有机相。 8.2.5水相移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），颠倒混匀10min， 10000rpm离心1min分离水相和有机相。 8.2.6水相移至新的1.5mL离心管中，加入100μL10mol/L乙酸铵（附录B.4），混匀后，再加入2 倍体积（-20℃）预冷的无水乙醇混匀，-20℃静置2h。10000rpm离心10min，弃上清。 8.2.770%乙醇洗涤沉淀2次，每次，10000rpm离心5min，弃上清。无色透明的DNA沉淀于室温晾干。 8.2.8加入100μL灭菌水溶解DNA，备用，或者溶解于100μL灭菌的Tris-EDTA缓冲液（附录B.5） 并保存于-20℃。 8.3水体样品DNA提取 8.3.1取水体样品10mL～50mL，8000rpm～12000rpm离心10min～15min，弃上清。 8.3.2将沉淀以200μL0.85%无菌生理盐水重悬并转入1.5mL离心管，可再洗涤1次。 8.3.3加入100μL无DNA酶污染的Tris-EDTA缓冲液（附录B.5），置95～100℃沸水浴10min，冰浴5 min；12000rpm离心2min，取上清作为扩增反应模板。 8.3.4所得DNA可直接用于RPA反应，或-20℃保存备用。 8.4荧光RPA扩增 8.4.1荧光RPA反应体系 50μL反应体系，包括RPA反应试剂29.4μL、280mmol/L的醋酸镁2.5μL、上游引物（10μmol/L） 2μL、下游引物（10μmol/L）2μL、探针（10μmol/L）0.6μL，DNA模板2μL，灭菌水11.5μL。 注：将除醋酸镁和模板DNA以外的所有成分加入装有RPA反应试剂干粉的反应管中，充分涡旋混匀， 瞬时离心（约3s～5s，≤3000rpm），使液体汇集至管底。打开反应管，向反应管的管盖上加入2.5μL 的醋酸镁，然后向反应管中加入模板DNA，充分混匀并瞬时离心（约3s～5s，≤3000rpm）。 8.4.2荧光RPA反应条件 将反应管置于荧光检测仪中，39℃，20min。在反应过程中实时监测荧光信号。 8.4.3实验对照 8.4.3.1毒力基因检测 毒力基因检测分别设置空白对照、阴性对照和阳性对照： a）空白对照：以不含任何DNA的无菌水代替模板DNA。 b）阴性对照：使用不含有毒力基因pirA或pirB的副溶血弧菌、坎氏弧菌、欧文斯氏弧菌的标准菌 株的DNA代替模板DNA。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ423—2025 4c）阳性对照：以培养基培养的、同时含有毒力基因pirA和pirB的副溶血弧菌、坎氏弧菌或欧文斯 氏弧菌的DNA为模板。 8.4.3.2弧菌菌种鉴定 a）空白对照：以不含任何DNA的无