SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4462—2016 国境口岸01群和0139群霍乱弧菌和 霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法 Detection method for O1 serotype,O139 serotype vibrio cholera and enterotoxin by triplex real-time fluorescence PCR at frontier port 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4462—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：周冬根、王燕、李红、孙大为、郑剑宁、裘炯良、倪敏君、张升、张绮、杨天赐、 莫秋华。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4462—2016 国境口岸01群和0139群霍乱弧菌和 霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因三重实时PCR检测方法检 验的对象、标本采集、检验程序及结果判定报告。 本标准适用于国境口岸对O1群和0139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因的实验室检测 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 01群霍乱弧菌 O1serotypevibriocholera 菌体抗原由3种抗原因子A、B、C组成，又可分为3个血清型：小川型、稻叶型和彦岛型。根据表型 差异，O1群霍乱弧菌的每一个血清型还可分为2个生物型，即古典生物型和ElTor生物型。 3.2 0139群霍乱弧菌 O139serotypevibriocholera 其临床表现及传播方式上与01群霍乱弧菌完全相同，但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集， 抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长。 3.3 V 霍乱肠毒素 vibrio cholera enterotoxin 是目前已知的致泻毒素中最为强烈的毒素，是肠毒素的典型代表。作用于肠细胞膜表面上的受体， 导致肠黏膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进人肠腔而发生剧烈吐泻 4检测对象 4.1疑似病人的排泄物、呕吐物 4.2被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的交通工具、行李、货物、集装箱、邮包、饮用水、压舱水、污 水、餐饮用具、生活用品。 5 主要仪器设备 本方法使用的主要仪器如下： 1 SN/T 4462—2016 超净工作台； 二级生物安全柜； 微型混合器、涡旋振荡器； 冰箱：4℃；-20℃； 恒温金属浴； 普通台式离心机； 高速冷冻离心机（离心力可达20000g）； 可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头； 荧光PCR检测仪。 6主要试剂 本方法使用的主要试剂如下： QiagenmultiplexPCRkit检测试剂盒!； 无DNA酶的DEPC水； 引物和探针：引物和探针序列见表1。 表1 荧光PCR检测的引物和探针 引物/ 扩增片段 序列（5"-3"） 探针名称 大小/bp O1-F CCAGATTGTAAAGCAGGATGGA O1-R GGTCATCTGTAAGTACAAC 163 O1-P FAM-CCCGGAGTTTGTAAGCCCACTACCGGG-DABCYL 0139-F CATACCAACGCCCTTATCCATT 0139-R GCATGACTGGCATCCCAAAAT 120 0139-P HEX-CGGGTGAGAAAAGACAGCAATAACACCCG-DABCYL ctxA-F TCCGGAGCATAGAGCTTGGA ctxA-R TCGATGATCTTGGAGCATTCC 80 ctxA-P CY5-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-DABCYL 信息服务平 7 检验程序 7.1 样本采集 7.1.1 粪便样本采集 采集自然排出的新鲜大便于灭菌容器中，水样便采集1mL～3mL，成形便采集1g~3g；亦可用已 湿润的直肠棉拭由肛门插入直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，确保退出的棉拭上有可见的粪便，把棉 拭放人灭菌容器中。粪便样本宜在发病早期（发病4d内），服用抗菌药物之前采集。 1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的 效果，则可使用这些等效产品。 2