ICS 07.080 CCS B 21 43 湖南省地方 标准 DB 43/T 3250—2025 基于高通量测序的农作物基因分型检测 技术规程 Code of practice for crop genotyping - high-throughput sequencing method 2025 - 07 - 18发布 2025 - 10 - 18实施 湖南省市场监督管理局 发布 DB 43/T 3250— 2025 I 目次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 样本质量控制 ....................................................................... 1 通用要求 ....................................................................... 1 叶片样本取样、保存及运输 ....................................................... 2 种子样本取样、 保存及运输 ....................................................... 2 DNA提取 ........................................................................ 3 DNA质控 ........................................................................ 3 5 高通量测序 ......................................................................... 4 步骤 ........................................................................... 4 联合探针锚定测序法 ............................................................. 4 边合成边测序法测序 ............................................................. 6 6 测序数据质控及基因分型检测 ......................................................... 7 测序数据质量分析及过滤 ......................................................... 7 基因分型 ....................................................................... 7 附录A（资料性） DNA完整性检测凝胶电泳图 ............................................. 9 附录B（资料性） FASTQ格式文件示例图 ................................................ 10 DB 43/T 3250— 2025 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：华智生物技术有限公司、袁隆平农业高科技股份有限公司、湖南师范大学生命科 学学院、湖南农业大学农学院、湖南省农业科学院作物科学研究所、深圳华大智造 科技股份有限公司、 湖南华智智造科技有限公司。 本文件主要起草人：黄刚、田冰川、杨远柱、梁满中、唐顺学、严明理、康雷、彭欢欢、谭司苡、 李为国、方妙全、李乐、许美娟、肖湘谊、王俊领、黄祖军、罗超伟、尹立新、唐宜、戴倩。DB 43/T 3250— 2025 1 基于高通量测序的农作物基因分型检测 技术规程 1 范围 本文件规定了基于高通量测序的农作物基因分型检测的样本质量控制、高通量测序、测序数据质控 及基因分型检测。 本文件适用于基于高通量测序的农作物基因分型。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30989 高通量基因测序技术规程 GB/T 33767.14- 2023 信息技术 生物特征样本质量 第14部分：DNA 数据 GB/T 35537 高通量基因测序结果评价要求 GB/T 35890- 2018 高通量测序数据序列格式规范 GB/T 37864 生物样本库质量和能力通用要求 GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则 3 术语和定义 GB/T 30989 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 基因型 genotype 个体在一个或多个基因座上的等位基因组合。 基因分型 genotyping 通过检测及分析个体 脱氧核糖核酸（ DNA）序列来确定其基因型的技术。 4 样本质量控制 通用要求 4.1.1 DNA 用于高通量测序的 DNA根据 GB/T 35537 中碱基测序准确率的要求进行质量控制， DNA同时满足 完整性和浓度要求才是合格样本。 4.1.2 样本 DB 43/T 3250— 2025 2 农作物样本及相关数据的使用遵守区域、 国家和国际的伦理规范。 农作物样本的取样、 前处理过程、 保存、销毁、运输等操作符合 GB/T 37864 的规定。 4.1.3 水和试剂 本文件所使用的水均为一级水，符合 GB/T 6682 规定的一级水要求。除非另有说明，在分析中仅使 用分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂用 0.22 μm膜过滤除菌，酶溶液避免反复冻融。 叶片样本取样、保存及运输 4.2.1 取样 农作物叶片样本取样要求如下： a) 在田间采集无病虫斑、无发黄枯萎、无霉变、无污染物的新鲜叶片样本后， 将叶片样本装入有 编号的塑料自封袋、牛皮纸袋、圆底 微量离心 管（EP管）或96孔深孔板中； b) EP管与自封袋要将口密封以防样本泄露或污染； c) 牛皮纸袋口折叠 3次进行封口以防样本泄露或污染； d) 96孔深孔板用硬滤纸板覆盖，用橡皮筋扎紧以防叶片样本泄露或污染。 4.2.2 保存及运输 本文推荐简单处理法、干燥处理法及冷冻处理法，其它能保障叶片样本在保存及运输中 DNA不降 解的方法均可适用。 4.2.2.1 简单处理法 样本保存运送时间小于 1 d，样本放入泡沫箱后加入蓝冰袋运送到实验室。 4.2.2.2 干燥处理法 样本保存运送时间大于 1 d但小于 1 w，根据水份含量高低分两种处理方法如下： a) 水份含量较低的样本，用二氧化硅硅胶将叶片干燥变脆后，密封保存或运送； b) 水份含量较高的样本，用真空冷冻干燥机将叶片冷冻干燥变脆后，密封保存或运送。 4.2.2.3 冷冻处理法 样本保存运送时间大于 1 w但不超过 6 m，样本用液氮速冻后存入- 80 ℃冰箱保存。样本装入有足 量干冰的泡沫箱进行长距离运输。 种子样本取样、保存及运输 4.3.1 取样 选取无病虫斑、无霉变、无污染的种子去净泥土或灰尘，装入有编号的塑料自封袋、牛皮纸袋、圆 底EP管或 96孔深孔板中。 4.3.2 保存 千粒重小于 50 g的种子样本，不少于 4 g或不低于 60粒。千粒重大于 50 g的种子样本，不少于 10 g或不低于 20粒。