SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4452—2016 出口虎、豹、狮源性成分定性检测方法 PCR-RFLP 方法 Identification of tiger leopard and lion derived materials in export product- PCR-RFLP method 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4452—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘淑艳、王刚、蒋丹、孙晓飞、丁健、万超、林长军、曹际娟。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4452—2016 出口虎、豹、狮源性成分定性检测方法 PCR-RFLP方法 1范围 本标准规定了虎、豹、狮源性成分的PCR-RFLP检测方法。 本标准适用于虎、豹、狮及其来源性物品中虎、豹、狮成分的定性检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 3.1.1 虎源性成分tigerderivedmaterials 虎特异性DNA片段。 3.1.2 豹源性成分leopardderivedmaterials 乐准信息服务 豹特异性DNA片段。 3.1.3 狮源性成分 lionderived materials 狮特异性DNA片段。 3.1.4 简并引物 degenerateprimer 代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。核甘酸链中除出现正常的A、T、 S=C/G, W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T)。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 1 SN/T 4452—2016 RFLP：限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthpolymorphism) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） 4 原理 利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷/异戊醇抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为 模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应 进行确证。 5试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物（对）序列：见表1。 表1引物序列 被检测基因 基因名称 引物序列（5°-3'） 目的片段长度/bp L14724 5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3' 哺乳动物通用引物 423 H15149 5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3 PL1Fa 5'-CYAAYAACCCCTCAGGAATGGT-3 虎、豹、狮简并引物 325 PL2Rb 5'-CGTTGTTTGGAWGTGTGGAGRGC-3 "F为Forward(正向）。 bR为Reverse(反向）。 5.2 2TaqDNA聚合酶。 5.3 限制性内切酶：HinfI酶、MboI酶 5.4RNA酶溶液：5μg/μL。 5.5 5琼脂糖；电泳纯。 5.7 三氯甲烷。 5.8异戊醇。 5.9 异丙醇。 5.10 无水乙醇。 5.11 70%乙醇。 5.12 EDTA:1 μmol/L,pH 8.0。 5.13 Chelex溶液：10%。 5.14 PBS缓冲液:0.05mol/L,pH7.4。 5.15 溴化乙锭贮存液：10mg/mL。 5.16 10倍加样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖。 5.17 消化液:10mmol/L Tris-HCl,0.5% SDS,1 mmol/L CaCl,0.2mg/mL蛋白酶K,pH 8.0。 5.18 裂解液：1%十六烷基三甲溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide，CTAB），0.05mol/L三（羟甲 基)氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride,Tris-HCl,pH 8.o],0.7mol/LNaCl, 2