ICS65.020.20 CCSB05 SDYY 团 体 标 准 T/SDYY251—2026 ‘美红’苹果主要病毒病快速鉴定与高效脱 除技术规程 Technicalcodeforrapididentificationandefficienteliminationofmajorviral diseasesin‘Meihong’apple 2026-02-13发布 2026-03-13实施 山东园艺学会  发布 全国团体标准信息平台 T/SDYY251—2026 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东园艺学会提出并归口。 本文件起草单位：山东农业大学、山东省果树研究所、山东省烟台市农业科学研究院、山东烟富农 业科技有限公司、烟台大为苗木有限公司、烟台市蓬莱区果业技术推广中心。 本文件主要起草人：王楠、徐同尧、于蕾、刘文军、邹琦、陈学森、张宗营、尹成苗、李林光、王 海波、何晓文、宋来庆、赵玲玲、王平、马明德、孙英杰、王继秋、徐月华、季兴禄。 全国团体标准信息平台 T/SDYY251—2026 2‘美红’苹果主要病毒病快速鉴定与高效脱除技术规程 1范围 本文件规定了‘美红’苹果的病毒病快速鉴定技术、病毒病高效脱除技术以及无毒苗木繁育的技术 要求。 本文件适用于‘美红’苹果无病毒苗木的培育和生产活动。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版 本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY329-2006苹果无病毒母本树和苗木 NY/T1085-2006苹果苗木繁育技术规程 NY/T2719-2015苹果苗木脱毒技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语与定义。 4病毒病快速鉴定技术 4.1病毒病类型 苹果病毒病可划分为潜隐性与非潜隐性两大类型。生产实践中，针对‘美红’苹果需重点检测的病 毒种类包括锈果类病毒（Applescarskinviroid，ASSVd）、坏死花叶病毒（Applemosaicvirus，ApMV）、 褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV）、茎沟病毒（Applestemgroovingvirus，ASGV） 及茎痘病毒（Applestempittingvirus，ASPV）。 4.2待测样品总RNA的提取 利用植物总RNA提取试剂盒提取待检测样品的总RNA。 4.3RT-PCR引物设计 按照附录A的序列进行引物设计。 4.4RT-PCR扩增体系 全国团体标准信息平台 T/SDYY251—2026 325μL体系：cDNA1μL，2×RapidTaqMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物（10µM）各1μL， ddH2O9.5μL。 4.5RT-PCR反应程序 95℃预变性30s，变性15s；茎痘病毒54℃、茎沟病毒58℃、褪绿叶斑病毒59℃、锈果类病毒 58℃、坏死花叶病毒58℃退火15s，72℃延伸30s循环35次；72℃延伸10min。 4.6琼脂糖凝胶电泳检测 检测过程中同步设置阳性与阴性对照，具体操作如下：采用浓度为1%的琼脂糖凝胶对PCR扩 增产物进行电泳检测，上样体积5µL～8µL，电泳缓冲液选用1×TAE体系；电泳时将仪器调至恒压模 式，电压设置为154V，电泳时长保持在18min～25min，借助凝胶成像系统拍照记录电泳结果。结果 判定标准为：若样品条带与阳性对照目的条带一致，则为阳性，携带病毒；若样品未出现对应目的条带， 则为阴性，表明样品未携带病毒。 5病毒高效脱除技术 5.1离体植株无菌体系的建立 按照NY/T2719-2015的规范要求进行幼芽脱毒处理；将处理后的幼芽接种至灭菌的初代培养基中， 配方为MS+5.1g/L～5.3g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值调至5.8；接种后置于人工气候室培养，培养 条件为温度25±2℃、光照强度3000lx、光照时长16h/d。培养约20d后，外植体即可萌动生长，以 此建立离体植株的无菌营养繁殖体系。 5.2继代培养 在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养基中，配方为：MS+0.1mg/LIBA+0.5mg/L 6-BA+琼脂5.1g/L～5.3g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8，经过30d后可产生大量丛生芽。 5.3超低温处理 将继代培养的带毒离体植株转接至MS+6-BA1.0mg/mL+IBA0.2mg/mL培养基中，培养20～25 d，选取再生芽中的单芽进行病毒检测，明确植株的带毒状态。选取株高1.0～2.0cm再生芽，在超净 工作台上分割为单芽后，接种至含MS+0.4mol/L蔗糖+0.4mol/L甘油的培养基中，进行2d预培养。 随后在解剖镜下剥取茎尖，放入60%玻璃化溶液PVS2中，于25℃条件下处理20min；随即转入经配 方优化的玻璃化溶液PVS2（成分为MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4M蔗糖，pH 调至5.8），在0℃环境中处理100min，期间更换1次PVS2溶液；之后迅速投入液氮中保存70min。 全国团体标准信息平台 T/SDYY251—2026 4从液氮中取出茎尖，立即置于40℃水浴中90s，再用1.2M蔗糖培养液处理10min，洗涤1次，直至 茎尖漂浮于培养液表面即可。 5.4病毒抑制剂处理 将洗涤后的茎尖放置含利巴韦林20ug/L~25ug/L茎尖分化培养基上暗培养7d，然后转移至光照强 度3000lx培养。30d后根据茎尖生长情况更换带有病毒抑制剂的培养基。待苗长至3cm时，取叶片进 行病毒RT-PCR检测。经检测不含病毒后，该植株即可确定为无病毒母株。 5.5无病毒母株生根培养 将无病毒母株转接至生根培养基中培养，配方为1/2MS+IAA1.5mg/L+IBA0.2mg/L+5.3g/L琼 脂+20g/L蔗糖，pH值调至5.8。培养20d～25d，待组培苗根系长度达1.0cm～2.0cm、根数不少于 3条时，即可开展炼苗操作。 5.6无病毒母株炼苗 炼苗流程：先将生根组培苗置于自然光环境下炼苗2d；第3d拧松组培瓶瓶盖，第4d完全揭开瓶 盖，每日早、中、晚各喷施清水1次；第5d用镊子取出组培苗，放入清水中清洗培养基残留。炼苗全 程需置于室内背阴处，避免阳光直射及强通风环境。 5.7无病毒植株的移栽 经炼苗的无病毒组培苗，先用70%甲基托布津800倍液浸泡30s，再以湿润水草包裹组培苗基部1 cm处，移栽至72孔育苗穴盘，将穴盘移入温室内的小拱棚中，棚顶覆盖塑料薄膜并加盖遮阳网，棚内 湿度保持在65%～70%、温度维持在25±3℃。培育2周后拆除塑料薄膜和遮阳网，让幼苗适应棚内 环境。再经3d适应性培养，将成活的组培苗转入50孔加深育苗穴盘，置于温室培育。育苗基质采用 进口草炭土与蛭石按3:1的比例混配。 5.8脱毒品种母本圃的建立 按照NY329-2006的规范要求，建立脱毒品种母本圃。 6无病毒苗木繁育 按照NY/T1085-2006的规范要求进行无病毒苗木繁育。从脱毒品种母本圃采集无病毒接穗，嫁接 在无病毒砧木上，进行双脱毒苗木繁育。 全国团体标准信息平台