ICS 65.020.01 CCS SAASS B 05 团体 标准 T/SAASS 342—2026 玉米淀粉废水中酵母菌菌种分离与保藏技 术规程 Technical code of practice for the isolation and preservation of yeast strains from corn starch wastewater 2026-02-11发布 2026-02-11实施 山东农学会 发布 全国团体标准信息平台 T/SAASS 342 —2026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 山东省农业科学院 提出。 本文件由山东农学会提出并归口。 本文件起草单位： 山东省农业科学院、 山东爱福地生物股份有限公司、 青岛和协生物科技有限公司、 山东种业智科农业服务集团有限公司、赤峰市宁城县农牧局。 本文件主要起草人：陈高、康佳、邵亚会、宣宁、耿耘、边斐、张樱馨、杨文龙、魏祥圣、倪海平、 赵红军、王贤举、李鹏、陈秋明。 全国团体标准信息平台 T/SAASS 342 —2026 1 玉米淀粉废水中酵母菌菌种分离与保藏技术规程 1 范围 本文件规定了玉米淀粉废水样品中分离、 纯化、 鉴定酵母菌， 以及进行短期和长期保藏的技术要求、 操作方法和质量控制的要求。 本文件适用于玉米淀粉 废水环境中分离和保藏 的酵母菌菌种。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 1736 微生物肥料菌种鉴定技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文 件。 3.1 玉米淀粉废水 corn starch wastewater 在以玉米为原料生产淀粉及其衍生物的过程中，主要来自浸泡、胚芽分离、纤维洗涤等工序所产生 的高浓度有机废水 。 4 仪器与试剂 4.1 仪器设备 无菌采样器、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、光学显微镜、 PCR仪、电泳 仪、冷冻离心机、冰箱 、超低温冰箱 -80℃、液氮罐、 pH计、天平、移液器。 4.2 培养基与试剂 YPD培养基、麦芽汁培养基、孟加拉红培养基、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（ PBS）、甘油、二甲 基亚砜（ DMSO）、革兰氏染色液、美兰染色液、氯霉素、庆大霉素等，所用试剂纯度应为化学纯或以上。 相关培养基配方 见附录A。 5 总体技术流程图 全国团体标准信息平台 T/SAASS 342 —2026 2 图1 玉米淀粉废水酵母菌株筛选与保藏整体的流程图 6 样品采集与预处理 6.1 采样位点 应选择在玉米淀粉生产企业废水处理站的后端能代表综合水质的位置进行采样。避免在水面浮渣 层或池底沉淀物过多处采集。 6.2 采样工具与容器 使用无菌玻璃瓶或聚乙烯塑料瓶作为采样容器。采样前， 容器应清洗干净并经 121℃、20 min高压蒸 汽灭菌。采样时应佩戴无菌手套。 6.3 采样方法 采用瞬时采样法， 将采样瓶口对准水流方向，浸入液面下 20 cm～50 cm处，打开瓶盖，让废水充满 容器，严格遵循无菌操作规范，尽量减少外部污染，并确保样品充满整个容器以降低氧气残留。 6.4 样品记录与标识 采样后应立即贴上标签， 注明样品编号、 采样地点、 采样时间、 采样人等信息， 并填写样品登记表。 样品应在 4 h内送达实验室进行预处理；若不能及时送达，需在 4℃条件下冷藏保存与运输，且保存时间 不宜超过 24 h。 6.5 样品预处理 6.5.1 初步过滤 全国团体标准信息平台 T/SAASS 342 —2026 3 到达实验室后，应立即使用无菌纱布或定性滤纸对废水样品进行初步过滤，以去除样品中残留的颗 粒性杂质如淀粉颗粒、 纤维等。 6.5.2 富集与调节 根据废水具体性状及目标酵母菌的特性，可选择以下一种或多种方法进行预处理： a) 高浓度有机废水的稀释处理：若样品化学需氧量（ COD）较高，应使用无菌生理盐水进行 10倍 梯度稀释；若初步稀释后浓度仍偏高，可进一步提高稀释倍数，直至样品 COD预估浓度低于后 续检测方法的线性范围上限。通常建议将样品稀释至 1000 mg/L以下，再进行后续预处理 ； b) pH调节：使用无菌的 NaOH或HCl溶液将样品 pH值调节至4.5～5.5，以抑制细菌生长并有利 于酵母菌增殖 ； c) 营养补充：可根据需要向样品或其上清液中加入 0.5%～2%（w/v）无菌葡萄糖或 0.1%～0.5% （w/v）酵母浸粉，以促进酵母菌生长 ； d) 富集培养：将上述处理后的样品置于恒温摇床中，在 25℃～28℃、120 rpm～150 rpm条件下培 养24 h～48 h，实现酵母菌的初步富集 ； e) 静置沉淀：取富集后的样品， 于4℃静置1 h～2 h，取上清液进行后续操作 ； f) 离心浓缩： 取部分上 清液或富集液， 在 4℃、5000 rpm～8000 rpm条件下离心 10 min～15 min， 收集菌体沉淀，用无菌生理盐水重悬，用于后续分离。 6.5.3 预处理后样品的保存 经预处理后的样品或富集液应尽快用于酵母菌的分离。若需短暂保存，应置于 4℃冰箱，且不宜超 过12 h。 7 分离与纯化 7.1 分离 7.1.1 分离方法 采用稀释涂布法或划线分离法进行分离。优先使用稀释涂布法，该方法便于后续的菌落计数与单菌 落挑取。操作时，对样品进行 10-1～10-6梯度稀释，并选择 2个～3个适宜的稀释度进行涂布，以确保获得 清晰、可计数的单菌落。 7.1.2 培养基 使用适合于酵母菌分离的选择性培养基，如高糖废水样品优先使用麦芽汁培养基，高氮废水样品优 先使用YPD培养基。为抑制细菌生长，可在培养基中加入适量过滤除菌的氯霉素或庆大霉素，使其终浓 度分别达到 50 μg/mL，具体方法 按照GB 4789.28的规定执行。 7.1.3 培养与观察 将涂布或划线后的平板倒置于 28℃～30℃恒温培养箱中培养 48 h～72 h。每日观察菌落生长情况， 挑取不同形态 ，如圆形、隆起、边缘整齐、表面光滑 /粗糙、颜色等疑似酵母菌单菌落，并进行标记。 7.2 纯化 7.2.1 纯化方法 对初分离的疑似单菌落，采用平板划线法进行至少两次的重复纯化，直至在显微镜下观察证实为形 态一致的纯培养物。 7.2.2 镜检 挑取少量纯化后的酵母菌菌体，制作水 压片，并使用美兰染液进行染色。随后于光学显微镜下进行 形态学观察。酵母菌属于单细胞真核微生物，镜下可见其细胞形态多为圆形、卵圆形或椭圆形，并常可 观察到典型的出芽繁殖现象。 全国团体标准信息平台 T/SAASS 342 —2026 4 7.3 鉴定 7.3.1 形态学与培养特征鉴定 记录纯化菌株在平板上的菌落特征 如大小、形态、颜色、表面、质地等及在液体培养基中的生长情 况，具体操作 按照NY/T 1736的规定执行。 7.3.2 分子生物学鉴定 作为最终确证手段， 应进行分子生物学鉴定， 采用商品化酵母基因组 DNA提取试剂盒获取高质量 DNA； PCR扩增：选用真菌通用引物 ITS1/ITS4 扩增菌株的 rDNA ITS 区序列，或选用 NL1/NL4引物扩增 26S rDNA D1/D2区序列；将测序所得序列在 NCBI等国际公共数据库中进行 BLAST比对。对于ITS序列，与已知菌株 相似性≥ 98.5%；对于D1/D2区序列，该阈值通常为≥ 99%通常提示为同属， 并通过构建系统发育树确定 其分类学地位。 7.3.3 鉴定结果记录 所有分离纯化后的菌株应被赋予唯一编号，并建立包括其来源、分离日期、形态特征、分子鉴定信 息在内的详细菌株档案。 8 菌种保藏 8.1 短期保藏 8.1.1 斜面低温保藏 将生长良好的酵母菌斜面培养物置于 4℃冰箱保藏。保藏期 2个～4个月，到期前需转接。 8.2 长期保藏 8.2.1 甘油管冷冻保藏 酵母菌菌种甘油冻存保藏的标准操作步骤如下： a) 将生长至对数后期的酵母菌液 ，菌悬液浓度 要求不低于1.0×10⁸ CFU/mL，与无菌的 40%～50% 甘油溶液等体积混合，使甘油终浓度为 20%～25%。 b) 分装于无菌冻存管中，每管 1 mL～2 mL，并使用螺纹密封与 Parafilm 缠绕的方式确保管口密 封。 c) 置于-80℃超低温冰箱中长期保藏。 8.2.2 液氮保藏 酵母菌菌种液氮保藏的标准操作步骤如下： a) 用15%～20%的甘油或 5%～10%的DMSO作为冷冻保护剂制备菌悬液。 b) 分装于冻存管，经程序控速降温或置于 -80℃预冷1 h～2 h后，转入液氮气相或液相