ICS 65.020.01 CCS SAASS B 05 团体 标准 T/SAASS 341—2026 盐碱地水稻根际促生菌分离与保藏技术规 程 Technical code of practice for isolation and preservation of rice rhizosphere growth - promoting bacteria in saline -alkali soil 2026 - 02 - 11发布 2026 - 02 - 11实施 山东农学会 发布 全国团体标准信息平台 T/SAASS 341 —2026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省农业科学院提出。 本文件由山东农学会归口。 本文件起草单位：山东省农业科学院、施可丰化工股份有限公司、山东爱福地生物股份有限公司、 赤峰市农牧技术推广中心、山东种业智科农业科技服务有限公司。 本文件主要起草 人：宣宁、陈高、邵亚会、耿耘、张樱馨、边斐、杨文龙、康佳、山东廷、苑喜军、 巩俊花、魏祥圣、赵红军、解晓梅、李鹏、查娜，鲍新玥，聂大杭。 全国团体标准信息平台 T/SAASS 341 —2026 2 盐碱地水稻根际促生菌 分离与保藏技术规程 1 范围 本文件规定了盐碱地水稻根际土壤样品 采集以及促生菌分离、纯化、功能鉴定、菌种保藏及记录建 档的技术流程 。 本文件适用于盐碱地水稻根际促生菌分离、筛选 、鉴定与保藏。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 46408 -2025 微生物资源机构数据管理及发布规范 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存 NY/T 1121.2 土壤检测 第2部分：土壤 pH的测定 NY/T 1121.16 土壤检测 第16部分：土壤水溶性总盐量的测定 NY/T 1736 -2009 微生物肥料菌种鉴定技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 水稻根际 rhizosphere of rice 水稻根系周围、受根系活动强烈影响的微域土壤环境，通常指距根表数毫米范围内的土壤。 根际促生菌 plant growth promoting rhizobacteria 能够直接或间接促进植物生长、 增加作物产量、 防治病虫害 、 且能在水稻根系稳定定植 的包括细菌、 放线菌、 丝状真菌、酵母菌、 蓝藻等在内的根际微生物。 4 仪器与试剂 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡培养箱、恒温培养箱、 pH计、光学显微镜、 PCR仪、电泳 仪、冷冻离心机、 -80℃超低温冰箱、液氮罐 、原子吸收光谱仪、分光光度计 等。实验室生物安全条件 应符合GB 19489 的要求。 主要试剂 培养基： LB培养基、 R2A培养基、硅酸盐培养基、有机磷水解培养基、无机磷水解培养基、 阿须贝 无氮培养基 、CAS检测培养基、 ACC脱氨酶检测培养基 （含 ADF培养基和 DF培养基） 、 产IAA检测培养基 等， 所用试剂纯度应为化学纯或以上。 相关培养基配方参见附录 A。 5 操作流程 全国团体标准信息平台 T/SAASS 341 —2026 3 图1 盐碱地水稻根际促生菌分离与保藏操作流程 6 技术要点 样品采集 6.1.1 采样时间 于水稻分蘖盛期或抽穗期进行。 6.1.2 采样方法 选择长势均匀的植株，按“ S”形或五点法进行取样。在盐碱地取样时，需同时依据土壤的盐度（用 电导率EC值衡量） 和碱度 （用 pH值衡量） 来综合判断土壤类型并调整根团采集深度： 对于重度盐碱地 （ EC ＞0.8 dS/m或pH＞9.0） ， 采集深度为 5 cm～10 cm； 对于中度盐碱地 （ EC 0.4 dS/m～0.8 dS/m或pH值8.0～ 9.0），采集深度为 3 cm～5 cm；对于轻度或非盐碱地则可按常规采集。 若土壤同时存在盐化与碱化， 以 更高的危害等级为准。用铲子挖出完整根团，立即存放于 4℃冰盒中运回实验室，在超净工作台内用灭 菌刀片刮取根表 0 mm～4 mm的土壤作为根际土样。 操作按照 NY/T 1121.1 的规定执行。 6.1.3 样品记录 全国团体标准信息平台 T/SAASS 341 —2026 4 详细记录样品编号、采集地点、采集时间、土壤盐度 、土壤碱度、土壤盐分组成类型以及水稻品种 等信息。其中，土壤盐度 测定应按照 NY/T 1121.16的规定执行；土壤碱度测定应按照 NY/T 1121.2 的规 定执行。对于土壤盐分组成类型，例如氯化物型或硫酸盐型等，应在条件允许的情况下尽可能测定并记 录。 6.1.4 样品贮存 采集的样品应立即放入 4℃冰盒中转运，并于 24 h内处理完毕，或于 -20℃短期保存。 促生菌的分离与纯化 称取10 g根际土样 ，加入90 mL适宜的无菌稀释液 ，于28℃、180 r/min 条件下振荡 30 min。稀释液 应选择与采样地土壤盐度接近的无菌盐水溶液，例如 0.85% NaCl 的无菌生理盐水 、1%～3%的NaCl溶液， 或根据土壤电导率 EC值进行配制。 对于放线菌， 需先将 土壤样品 55℃热处理 6 min～10 min或2%苯酚处理。 6.2.1 梯度稀释 取上清液进行 10倍系列梯度稀释（ 10-1至10-6）。 6.2.2 分离培养 采用涂布法或划线法， 将 100 μL各浓度稀释液接种于含不同 NaCl浓度梯度与不同 pH梯度的分离培养 基上，其培养基选择需依据目标微生物类型而定：细菌使用 R2A或LB培养基，放线菌使用高氏一号培养 基，丝状真菌使用 PDA或察氏培养基，酵母菌使用 YPD培养基，蓝藻使用 BG-11培养基；接种时 根据采样 地土壤的实际盐度与碱度，组合选择与之匹配的 NaCl浓度与pH值进行双重筛选，每个盐度与 碱度的条件 组合需设置 3个重复，并于 25℃～30℃倒置培养。 6.2.3 纯化 挑取不同形态的单一菌落，进行多次划线纯化，直至获得纯培养物。 6.2.4 菌株形态鉴定 根据所纯化菌株的类别进行形态观察： a) 细菌：观察菌落形态，并进行革兰氏染色镜检，观察菌体细胞形态、大小、 颜色、质地、光泽 等，是否有荚膜、是否形成芽孢等 ； b) 放线菌：观察菌落的大小、形状、表面状况、气生菌丝和基内菌丝的颜色及可溶性色素。通过 插片法在显微镜下观察气生菌丝、孢子丝的形态 ； c) 丝状真菌：观察菌落质地、颜色、生长速度、色素等 ； d) 酵母菌：观察菌落大小、形状、质地、颜色等，并制成水浸片观察细胞形态和无性繁殖方式 ； e) 蓝藻：观察菌落形态、颜色、质地等，并制成水浸片在显微镜下观察藻丝形态、细胞排列、有 无异形胞、厚垣孢子等特征。 遗传特性鉴定及分类学地位鉴定 对纯化菌株进行基因测序分析， 所用引物应包含以下范围： a) 细菌、 蓝藻与放线菌： 扩增 16S rDNA 序列， 引物对 按照NY/T 1736 -2009附录D（27F/1492R ）； b) 酵母菌：扩增 26S rDNA D1/D2 区域或ITS序列，引物对 按照NY/T 1736 -2009附录D（NL- 1/NL-4或ITS1/ITS4 ）。 c) 丝状真菌：扩增 ITS序列或18S rDNA 序列，引物对 按照NY/T 1736 -2009附录D（ITS1/ITS4 或NS1/NS8）。 将测序结果在 NCBI、EzBioCloud 等数据库中进行比对，通常将序列相似度≥ 98.5%作为同种的重要 参考，并结合系统发育树确定其分类学地位。 促生潜能筛查 6.4.1 耐盐性鉴定 全国团体标准信息平台 T/SAASS 341 —2026 5 采用梯度压力法系统评估菌株的耐盐能力。将活化后的菌株点接或划线于含有不同浓度 NaCl的固 体培养基上， 浓度梯度可设置为 1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%等，以不含添加 NaCl的培养基作为对 照。 在适宜温度下培养一定时间后， 观察并记录其能够生长的最高 NaCl浓度。菌株的耐盐性筛选标准为： 至少能在含 3% NaCl的培养基中正常生长，且通常要求其菌落直径或生物量达到对照组的 50%以上。 6.4.2 耐碱性鉴定 采用梯度 pH法鉴定菌株的耐碱能力 。将活化后的菌株点接 或划线于经无菌缓冲液（如碳酸钠 -碳酸 氢钠体系）精确调节 pH的固体培养基上， pH梯度可设置为 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，以pH约7.0的 培养基作为对照。在适宜温度下培养 3 d～7 d后观察并记录其能够生长的最高 pH。菌株的耐碱性筛选标 准为：能够在 pH值10.0及以上条件下生长，且通常要求其菌落直径或