ICS 65.020.01 CCS SAASS B 05 团体 标准 T/SAASS 332—2026 豌豆基因编辑技术体系构建技术规程 Technical code of practice for establishing gene editing system in pea 2026 - 02 - 11发布 2026 - 02 - 11实施 山东农学会 发布 全国团体标准信息平台 T/SAASS 332 —2026 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省农业科学院提出。 本文件由山东农学会归口。 本文件起草单位：山东省农业科学院、盐碱地综合利用技术创新中心。 本规程起草人：李冠、李娜娜、贾凯华、杨永义、李润芳、田汝美、刘敏、白静、谢坤、宫永超。 全国团体标准信息平台 T/SAASS 332 —2026 1 豌豆基因编辑技术体系构建技术规程 1 范围 本文件规定了豌豆基因编辑 技术体系构建 的试验平台条件、体系构建准备、体系构建 流程和档案管 理技术要求 。 本文件适用于 采用CRISPR/Cas 基因编辑 技术开展 豌豆基因功能研究、基因编辑 育种相关研究、材料 创制及技术 操作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27428 植物生物安全实验室通用要求 GB/T 46433.1 生物技术 基因组编辑 第1部分:术语 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 A. Rhizogenes ：根瘤菌（ Agrobacterium rhizogenes ） bp：碱基对（ Base Pair ） Cas9：CRISPR关联基因编码的蛋白（ CRISPR associated 9 ） CRISPR：成簇规律间隔短回文重复序列（ Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats） U6 snRNA ：小核RNA（small nuclear RNA ） DH5α：一种大肠杆菌菌株，常用于分子克隆实验，是一种高效的 DNA转化宿主。 DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid ） E. Coli：大肠埃希氏 菌（Escherichia coli ） Golden Gate ：一种基因组拼接技术，通过限制性内切酶和 DNA连接酶高效拼接多个 DNA片段。 Hi-TOM：用于高通量突变检测的在线工具，主要用于基因编辑后的突变鉴定。 K599：一种根瘤菌菌株，广泛用于植物转基因实验中的基因导入。 NGG：PAM序列中的常见三核苷酸（ N表示任何碱基， G是鸟嘌呤） OD600：600 nm波长下的光密度（ Optical Density at 600 nm ） PAM：识别序列（ Protospacer Adjacent Motif ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） sgRNA：单链引导 RNA（Single Guide RNA ） sgRNA scaffold ：sgRNA支架结构，是 CRISPR/Cas9 系统中引导 RNA的一个部分，帮助保持其结构 功能。 tRNA：转运RNA（Transfer RNA ） 全国团体标准信息平台 T/SAASS 332 —2026 2 TY：胰蛋白胨和酵母提取物组成的一种培养基（ Tryptone and Yeast extract），用于微生物的培 养。 5 基本要求 实验场所 实验场所及设施应符合 GB 19489 、GB/T 274 28及植物基因工程相关生物安全管理规定。 仪器设备 所需仪器设备包括 PCR仪、核酸电泳与凝胶成像系统、超微量分光光度计、高速离心机、涡旋振荡 器、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台及高压灭菌锅。用于豌豆无菌苗和转化材料培养的设施应具备 温度、光周期及湿度可调控功能。 6 体系构建准备 植物材料 选用适合进行农杆菌转化的豌豆品种或其他合适的基因型材料。 菌株 E. Coli DH5α用于质粒克隆与扩增； A. rhizogenes K599用于豌豆遗传转 化，见附录 A.1。 载体 包含Cas9表达单元及 sgRNA表达骨架的模块化载体，见附录 A.2。 酶与主要试剂 所需主要试剂包括分子生物学常用酶制剂、核酸纯化试剂、突变检测试剂盒、植物基因组 DNA提取 试剂，以及植物培养所需的培养基及相关添加剂，见附录 A.3、A.4和A.5。 7 体系构建流程 U6启动子的筛选与克隆 通过序列同源比对在豌豆基因组中鉴定内源 U6 snRNA 基因，选取其转录起始位点上游 600 bp区域作 为候选启动子序列，并设计特异性引物对候选内源 U6启动子进行克隆。采用高保真 PCR扩增目标片段， 经凝胶纯化后连接至平端克隆载体，转化 DH5α，并通过抗性筛选、菌 落PCR、限制性酶切及测序分析验 证获得正确克隆。 中间载体的构建 基于验证正确的内源 U6启动子，采用酶切连接方法分别将 U6启动子与 sgRNA scaffold 连接，构建 sgRNA表达单元， 并将其克隆至含 Cas9表达框的双元载体中形成 sgRNA表达中间载体。 通过抗性筛选、 PCR 扩增、限制性酶切及测序分析对载体构建的正确性进行验证。 靶向载体的构建 根据目标基因序列设计满足 PAM为NGG的特异性 sgRNA表达盒，同时利用 tRNA-sgRNA融合表达策略以 提高基因编辑效率。采用 Golden Gate 组装方法，将 sgRNA表达盒组装至 sgRNA表达中间载体中，构建基 因编辑靶向载体，并将其转化至发根农杆菌 K599感受态细胞中，经检测验证获得阳性转化子。 瞬时遗传转化 挑选饱满干净、生长状态好的豌豆种子平铺在无菌培养皿中，将放置豌豆的培养皿放在密封状态良 好的干燥器中，将 300 mL次氯酸钠溶液放在 500 mL的小烧杯中，并将小烧杯放在干燥器内，移液枪取 20 全国团体标准信息平台 T/SAASS 332 —2026 3 mL浓盐酸加入放有次氯酸钠溶液的烧杯中，并迅速盖好干燥器的盖子，密闭消毒 10 h～12 h。将消毒后 的豌豆种子 接种于萌发培养基 ，在25℃条件下、 16 h光照/8 h黑暗的培养环境中培养约 7 d～10 d获得无 菌苗；发根农杆菌经活化后，于含相应抗生素的 TY液体培养基中，在 28℃、200 rpm条件下振荡培养至菌 液OD600为约0.6～0.8。取无菌苗子叶节并保留约 3 mm～5 mm下胚轴作为外植体，置于侵染液中侵染约 30 min。侵染后将外植体转入共培养培养基，在 28℃黑暗条件下共培养约 4 d；共培养结束后，经含羧苄青 霉素和头孢霉素的清洗液洗涤，转入毛状根诱导培养基，在 28℃黑暗条件下培养约 3周，并每约 10 d更 换一次新鲜的诱导培养基，以诱导毛状根形成，见附录 A.5。 突变检测与分析 从毛状根材料中提取基因组 DNA，针对各编辑靶位点设计特异性引物，对目标区域进行 PCR扩增，扩 增片段长度控制在 180 bp～250 bp。采用Hi-TOM试剂盒对 PCR产物开展高通量测序，将各样本测序数据与 参考序列进行比对分析，鉴定插入和缺失等突变类型。各靶点的编辑效率按式（ 1）进行计算： 𝐴=(𝐵 𝐶)×100 ································ ································ ········· (1) 式中： A——编辑效率； B——发生编辑的有效测序序列数； C——总有效测序序列数。 基因编辑高效性判定标准 基因编辑系统高效性的评价原则和方法按照 GB/T 46433.1 的规定执行。根据目标位点的突变类型 和编辑效率对 基因编辑系统的效率水平进行分级判定，分级标准见表 1。 表1 编辑效率分级标准表 效率等级 编辑效率 A 突变类型特征说明 高效 A≥50 以插入和缺失等靶向突变为主，突变类型清晰且一致性较好 中等 20≤A＜50 可检测到明确的靶向突变，但不同转化事件间效率存在一定差异 低效 5≤A＜20 靶向突变比例较低，突变类型分散 极低效或无效 A＜5 未检测到稳定的靶向突变或突变比例极低 体系构建流程图 豌豆基因编辑技术体系构建流程图见图 1。 全国团体标准信息平台 T/SAASS 332 —2026 4 图1 豌豆基因编辑技术体系构建流程图 8 档案管理 建立体系构建档案，档案内容主要记录植物材料，酶与主要试剂，载体构建流程，编辑效率结果分 析等，档案保存 2年以上。 全