ICS65.020.01 CCSB05 SAASS 团 体 标 准 T/SAASS329—2026 野生大豆种质遗传完整性检测技术规程 Technicalcodeofpracticeforgeneticintegritytestingofwildsoybeangermplasm 2026-02-11发布 2026-02-11实施 山东农学会  发布 全国团体标准信息平台 T/SAASS329—2026 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省农业科学院提出。 本文件由山东农学会归口。 本文件起草单位：山东省农业科学院。 本文件主要起草人：王栋、夏晗、李娜娜、杨永义、李润芳、宫永超。 全国团体标准信息平台 T/SAASS329—2026 2野生大豆种质遗传完整性检测技术规程 1范围 本文件规定了野生大豆种质遗传完整性检测的不同生活力群体的获取、SSR标记分析、结果统计与 判定方法等技术要求。 本文件适用于野生大豆种质遗传完整性的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T3543.4农作物种子检验规程第4部分：播种质量发芽试验 GB4404.2粮食作物种子第2部分：豆类 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 遗传完整性geneticintegrity 种质原始遗传组成状态，即在繁殖保存过程中要使其群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型 频率分布及各位点等位基因频率分布和其原始群体一致。 种质遗传完整性变化changesingeneticintegrityofgermplasm 种质贮藏过程中的遗传变化以及种质繁殖后其后代群体的遗传组成与亲代种质群体相比较发生了 变化。 遗传多样性指数geneticdiversityindex 用于量化一个种群或物种内部遗传变异丰富程度和分布均匀程度的数学指标，指数越高表明明遗传 多样性越丰富。 香农指数shannonindex 用于衡量遗传多样性或种群内基因多样性的指标，它量化了种群中不同基因型或等位基因的丰富度 和均匀度，指数值越高，说明种群内的遗传多样性越丰富，基因分布越均匀。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction） SSR：简单重复序列（SimpleSequenceVepeat） 5不同生活力群体的获取 材料准备 全国团体标准信息平台 T/SAASS329—2026 3以播种、田间管理、收获及成熟度一致的野生大豆种子为试验材料，至少3000粒种子。野生大豆种 子质量应符合GB4404.2的规定。 破除硬实 用布袋包裹野生大豆种子，放入液氮中浸泡4 min，然后将种子取出来在室温25℃下使其自然升温。 平衡含水量 将野生大豆种子放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件是相对湿度为45%，温度为25℃， 时间为30 d，测定种子含水量，直至7.3%～7.5%，若种子含水量达不到此标准，相同条件下继续平衡。 密封包装 将野生大豆种子平均分成若干份，每份用铝箔袋真空密封包装，即为一个处理群体，约300粒。每 个处理群体将用于之后的生活力检测、繁殖更新和SSR标记分析。 人工老化 采用倒序法进行人工老化，每隔2周进行一个处理群体的人工老化试验，将铝箔袋密封包装后的大 豆种子放置于人工老化箱内恒温老化，温度为40℃，试验结束时所有处理群体一起取出，以未经过老化 的处理群体作为对照，人工老化时间视大豆种质及所需的生活力梯度而定。 含水量再平衡 人工老化结束后，在25℃下将所有处理密封平衡2 d，可获得野生大豆不同生活力的亲代群体。 亲代生活力检测 亲代群体的发芽试验应按照GB/T3543.4的规定执行，并统计每个群体的发芽势、发芽率、发芽指 数和活力指数等生活力指标。 亲代繁殖更新 将不同生活力亲代群体的野生大豆进行田间繁殖更新，行距0.5 m，株距0.1 m，繁殖地块周围设置 隔离带，每个群体定植100株，并进行单株编号，得到其繁殖后代群体。 繁殖后代生活力检测 不同生活力的亲代群体收获后，进行单株脱粒后得到各自的繁殖后代群体种子，对繁殖后代每个群 体的每个单株也进行编号，编号与其亲代单株是一一对应关系。对繁殖后代群体进行发芽试验，并统计 每个群体的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等指标。 6SSR标记分析 处理样本 亲代及繁殖后代每个生活力群体取96个单株，采集幼嫩叶片，-80℃下保存备用。 提取基因组DNA 单株提取上述野生大豆种质亲代及繁殖后代各个群体的基因组DNA。提取步骤为： a)将野生大豆幼嫩叶片用镊子放入2.0 mL离心管中，每管加入一粒直径5 mm的钢珠后，进行下 一步操作或-80℃备用； b)将离心管迅速放入液氮中冷却，装入组织研磨仪中将叶片打碎，时间为30 s，频率为50 Hz， 注意动作要迅速，之后取出离心管加入1mL的SDS提取液，提取液事先放入65℃水浴中预热， 抑制DNA酶，加速蛋白质变性，促进DNA溶解，然后向离心管中加入10 μL的巯基乙醇，抑制 酚氧化为醌，充分混匀，也可剧烈震荡； c)将离心管放入65℃水浴中保温1 h，水浴过程中每10 min摇动一次； d)待样品冷却至室温后，加入1/5体积的5 MKAc，冰水混合物中放置30 min； 全国团体标准信息平台 T/SAASS329—2026 4e)12000 g离心10 min后，吸取1000 μL上清液加入到另一2.0 mL离心管中，在每管中加入等体 积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，体积比为25：24：1，充分振动15 min后，12000 g离心15 min； f)吸取800 μL上清液加入到另一2.0 mL离心管中，加入10 μLRNA酶（10 mg/μL）溶液，37℃ 水浴1 h或-4℃过夜； g)每管中加入800 μL的氯仿/异戊醇溶液，体积比为24：1，充分振动15 min后，12000 g离心 15min； h)吸取600 μL上清液加入到另一2.0 mL离心管中，每管加入0.6～1.0体积的异丙醇，轻轻混 匀后置于-20℃下30 min，12000 g离心10 min，收集沉淀； i)加入1 mL75%乙醇冲洗2次后，再用1 mL无水乙醇冲洗1次，置于真空离心机中，将DNA吹干 至无酒精味，加入100 μL1×TE溶解； j)样品在4℃备用，多余样品置于-20℃下长期保存； k)提取完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性（要求条带清晰、无明显拖尾）；采用核 酸蛋白测定仪检测浓度（要求DNA浓度为50 ng/μL～200 ng/μL）和纯度（OD260/OD280比值 为1.8～2.0），不符合标准的样本需重新提取。 SSR核心引物筛选 以对照群体的96个单株基因组DNA为模板，用野生大豆SSR引物进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰 胺凝胶电泳检测、银染显色及统计结果分析。根据每对引物在96个单株中的扩增结果，剔除不具备多态 性或多态性较低的引物，即期望杂合度低于0.5的引物，最终筛选获得20对高多态性核心引物。引物信 息见表1。 表1野生大豆遗传完整性分析SSR核心引物表 序号引物编号 引物序列 PCR产物大小连锁群 1Satt200正向序列GCGATAAATGGTTAATGTAGATAA 240 A1 反向序列GCGAAAGGACAGATAGAAAGAGA 240 2Satt177正向序列CGTTTCATTCCCATGCCAATA 112 A2 反向序列CCCGCATCTTTTTCAACCAC 112 3Satt415正向序列GCGTCTCCCTTAATCTTCAAGC 297 B1 反向序列GCGTGTGACGGTTCAAAATGATAGTT 297 4Satt474正向序列GCGAAATTTGGAAATGACATCTTAGAA 261 B2 反向序列GCGACGGGAGAAATTGGATGTGAAGAA 261 5Satt294正向序列GCGGGTCAAATGCAAATTATTTTT 283 C1 反向序列GCGCTCAGTGTGAAAGTTGTTTCTAT 283 6Satt365正向序列TGCTCCCCTCTGCCTTTTTTTCTATTTT 302 C2 反向序列AAGGATGAGTTTGATAAACATGAATGAAGAA 302 7Satt147正向序列CCATCCCTTCCTCCAAATAGAT 174 D1a 反向序列CTTCCACACCCTAGTTTAGTGACAA 174 8Sat_289正向序列GCGAATTCCAGCTTTTATCACTTTATGAC 276 D1b 反向序列GCGATTGGAAAGTGCCTTTTATGTT 276 9Satt186正向序列GGGAAGTTATAAGCAGAT 234 D2 反向序列GGGAATCCATTCCTGATGAGT 234 10Satt231正向序列GCGTGTGCAAAATGTTCATCATCT 237 E 反向序列GGCACGAATCAACATCAAAACTTC 237 11Satt146正向序列AAGGGATCCCTCAACTGACTG 290～310 F 反向序列GTGGTGGTGGTGAAAACTATTAGAA 290～31