ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 363—2026 血清型4h单核细胞增生李斯特菌检测技术 Detection technology for serotype 4h Listeria monocytogenes 2026 - 3 - 4发布 2026 - 3 - 4实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 363—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 扬州大学提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 扬州大学、国家食品安全风险评估中心、中国动物疫病预防控制中心、 安徽省动 物疫病预防与控制中心、江苏立华食品集团股份有限公司 。 本文件主要起草人： 焦新安、殷月兰、郭云昌、李薇薇、孙雨、陈静 、姚浩、 孙佳善、胡亚辰 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 363—2026 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时， 可能涉及到条目 9.8和附录 D相关专利 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件 下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以 下联系方式获得： 专利持有人姓名： 扬州大学 （殷月兰、宁海波、徐国晨、杜洪香、姚浩）。 地址：江苏省扬州市文汇东路 48号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 363—2026 1 血清型4h单核细胞增生李斯特菌检测 技术 1 范围 本文件规定了动物源样品中血清型 4h单核细胞增生李斯特菌的设备和材料、培养基和试剂、样品 采集、保存与运输、分离培养、生化鉴定、协同溶血反应、多重 PCR及荧光 PCR鉴定方法。 本文件适用于动物源样品中血清型 4h单核细胞增生李斯特菌的分离 及定性与定量检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改 单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 血清型4h单核细胞增生李斯特菌 serotype 4h Listeria moncytogenes 指细菌菌体抗原（ O抗原）为 4；鞭毛抗原（ H抗原）为 AB的特征。该血清型菌株的序列分型为 ST626，不能利用鼠李糖进行代谢。在羊血琼脂平板上，与马红球菌共培养时可观察到协同溶血现象。 在灌胃感染模型中，该菌株在小鼠脏器中的定植能力是现有强毒力李斯特菌的 200至400倍。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ base pair） CFU：菌落形成单位（ Colony forming units ） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylene diamine tetraacetic acid) FB：Fraser肉汤增菌液（ Fraser borth ） Lm：单核细胞增生李斯特菌（ Listeria monocytogenes ） OA：李斯特菌显色培养基（ Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti ） OD：光密度（ Optical density ） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 363—2026 2 PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸缓冲液（ tris aectate -EDTA buffer ） 5 试剂和耗材 5.1 试剂 5.1.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸 酶的容器分装。 5.1.2 缓冲蛋白胨水： 按附录 A中A.1制备。 5.1.3 含0.6 %酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂（ TSA -YE）：按A.2制备。 5.1.4 Fraser增菌肉汤（ FB1、FB2）：按A.3制备。 5.1.5 OA李斯特菌显色培养基： 按A.4制备。 5.1.6 5 % ~ 8 %羊血琼脂： 按A.5制备。 5.1.7 糖发酵管： 按A.6制备。 5.1.8 50× TAE缓冲液： 按A.7制备。 5.1.9 1.2 %琼脂糖凝胶： 按A.8制备。 5.1.10 2× Taq PCR Mix 。 5.1.11 无核酸酶水。 5.1.12 绿如蓝核酸染料。 5.1.13 DNA分子 Marker。 5.1.14 细菌基因组 DNA提取试剂盒。 5.2 耗材 5.2.1 锥形瓶： 250 mL、500 mL。 5.2.2 无菌吸管： 5 mL（具 0.1 mL刻度）。 5.2.3 无菌培养皿：直径 90 mm。 5.2.4 无菌摇菌管： 12 mL。 5.2.5 无菌接种环： 1 μL、10 μL。 5.2.6 无菌枪头： 10 μL、200 μL、1000 μL。 5.2.7 灭菌器械：解剖刀、剪刀、镊子、注射器及针头。 5.2.8 容器：带螺帽容器、灭菌自封口塑料袋。 5.2.9 个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、医用 防护口罩、医用一次性乳胶手套。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 363—2026 3 5.2.10 采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。 5.2.11 其他：无菌棉拭子、医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。 6 仪器设备 6.1 冰箱： 2 ℃ ~ 8 ℃ 。 6.2 恒温培养箱： 30 ℃±1 ℃ 、36 ℃±1 ℃ 。 6.3 高压灭菌锅：灭菌温度为 121 ℃，工作压力为 0.1 MPa。 6.4 恒温震荡培养箱。 6.5 电子天平：感量 0.01 g。 6.6 均质器。 6.7 干式恒温金属浴。 6.8 离心机。 6.9 基因扩增仪。 6.10 凝胶成像仪。 6.11 生物安全柜。 6.12 荧光定量 PCR扩增仪。 7 菌株 7.1 血清型 4h单核细胞增生李斯特菌 XYSN或其他等效菌株。 7.2 单核细胞增生李斯特菌 EGD -e或其他等效菌株。 7.3 伊氏李斯特菌（ Listeria ivanovii ）ATCC 19119 或其他等效菌株。 7.4 马红球菌（ Rhodococcus equi ）ATCC 6939 或其他等效菌株。 8 生物安全要求 样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照 GB 19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物 安全柜中进行，并做好个人防护 。 9 检验流程 血清型 4h单核细胞增生李斯特菌检验流程 按附录 B。 10 操作程序 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 363—2026 4 10.1 采集、运输与保存 10.1.1 样品采集与处理 10.1.1.1 一般要求 样品采集和处理应按照 NY/T 541有关规定进行，可采集粪便、肛拭子、肠道内容物、动物胴体、 肉组织样品等。 10.1.1.2 粪便样品 采集新鲜粪便 25 g以上， 不足 25 g的称取相应质量， 使用带螺帽容器或灭菌自封口塑料袋， 于 2 ℃ ~ 8 ℃条件下运送至实验室。 10.1.1.3 肛拭子样品 应取无菌棉拭子插入肛门或泄殖腔中，旋转 2 ~ 3圈，刮取直肠黏液或粪便，放入装有保护液的灭 菌离心管中送检。 10.1.1.4 肠道内容物样品 应在肠壁表面，用一次性注射器扎穿肠壁，从肠腔内吸取内容物放入装有平衡盐溶液的带螺帽容器 中送检；或将带有粪便的肠管两端结扎，从两端剪断装入灭菌自封口塑料袋后送检。 10.1.1.5 动物胴体样品 依照屠宰生产流程，用无菌蛋白胨水浸润的棉球在动物体表擦拭，擦拭面积约为 50 cm2 ~ 100 cm2 （视动物体型而定），然后将棉球置于无菌采样袋内密封保存并做好标记。对不同样品每次更换无菌一 次性乳胶手套。 10.1.1.6 肉组织样品 使用无菌采样袋采集肉组织样 25 g以上，密封保存并做好标记。 1