ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 355—2026 羊无浆体巢氏 PCR检测技术规范 Specification of nested PCR for the detection of sheep Anaplasm a 2026 - 3 - 4发布 2026 - 3 - 4实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 355—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由河南农业大学提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 河南农业大学 、河南牧业经济学院、永城市畜牧局 。 本文件主要起草人： 李森阳、 菅复春、张龙现、王荣军、李俊强、毋亚运、彭永帅、李晓迎、杜海 利、张素梅、宁长申、陈龙飞 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 355—2026 1 羊无浆体巢氏 PCR检测技术规范 1 范围 本文件规定了 嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、绵羊无浆体、山羊无浆体四种羊无浆体检测的巢式 PCR扩增要求，描述了相应的样品制备方法和结果判定的要求。 本文件适用 于羊无浆体 病的病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 668 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 兽医学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 无浆体 Anaplasma 无浆体（Anaplasma ）也称无形体， 主要包括的种类有： 绵羊无浆体 （ A. ovis） 、 山羊无浆体 （ A. capra）、 牛无浆体（ A. bovis）、嗜吞噬细胞无浆体（ A. phagocytophilum ）、中央无浆体（ A. centrale ）、边缘无 浆体（ A. marginale ）等。我国可以感染羊的无浆体有绵羊无浆体、山羊无浆体、牛无浆体和嗜吞噬细 胞无浆体 4种。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid ） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（ Deoxyribonucleoside Triphosphate ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffered Saline ） TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（ Tris-Acetate -EDTA Buffer ） 5 试剂、耗材和设备 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 355—2026 2 5.1 试剂 5.1.1 除非另有说明， 检测中所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求。 5.1.2 血液基因组 DNA 提取试剂盒 。 5.1.3 PCR 扩增试剂盒 。 5.1.4 r Taq 酶。 5.1.5 Loading Buffer。 5.1.6 1× TAE，见附录 A中A.1。 5.1.7 1.0%琼脂糖（电泳级），见附录 A.2。 5.1.8 DNA GREEN核酸染料。 5.1.9 巢式 PCR引物。分别参照嗜吞噬细胞无浆体 rrs基因、牛无浆体 AB1基因、绵羊无浆体 Msp4 基因、山羊无浆体 glta基因位点片段参考序列（见附录 B中B.1、B.2、B.3、B.4） ，设计嗜吞噬细胞无 浆体、牛无浆体、 绵羊无浆体 、山羊无浆体 巢氏 PCR扩增特异性引物序列，见附录 C。 5.1.10 DNA标准分子量。 5.1.11 阳性对照： 已经鉴定的 嗜吞噬细胞无浆体 、牛无浆体、绵羊无浆体和山羊无浆体 DNA样品。 5.1.12 阴性对照： 灭菌双蒸水。 5.2 耗材 5.2.1 1.5 mL离心管、 2 mL离心管。 5.2.2 100 mL 量筒、 1000 mL 量筒。 5.2.3 1000 mL 烧杯。 5.2.4 PE 手套。 5.2.5 抗凝采血管。 5.2.6 150 μL PCR 管。 5.2.7 不同规格的移液器和适配的枪头。 5.3 设备 5.3.1 冰箱。 5.3.2 自动平衡离心机。 5.3.3 恒温水浴锅。 5.3.4 PCR扩增仪。 5.3.5 核酸电泳系统。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 355—2026 3 5.3.6 凝胶成像仪。 6 生物安全要求 6.1 样品的采集 应按照 GB/T 27401 的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，对 待检测羊逐只进行颈静脉无菌采血，使用抗凝采血管收集血液样本，置于 4 ℃冰箱保存待用。 6.2 样本处理的生物安全要求 应按照 GB 19489 的相关要求，在生物安全 1级（ BSL-1）及以上实验室中进行检测工作，检测后的 样品的处理应按照 GB/T 27401 中有关规定进行处理。 7 PCR扩增鉴定 7.1 DNA提取 基因组 DNA的提取按照 市售的血液基因组提取试剂盒说明书进行操作。 7.2 反应体系及条件 7.2.1 无浆体巢氏 PCR反应体系与扩增程序 7.2.1.1 嗜吞噬细胞无浆体 巢氏 PCR反应体系与扩增程序 嗜吞噬细胞无浆体 第一轮 PCR扩增反应以提取的 DNA为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应 管，第一轮 PCR反应体系的配置见附录 D中表 D.1，第一轮扩增程序见附录 D.3。 第二轮 PCR扩增反应以第一轮扩增产物为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应管，第二轮 PCR 反应体系的配置见附录 D.2，第二轮扩增程序见附录 D.3。 7.2.1.2 牛无浆体 巢氏 PCR反应体系与扩增程序 牛无浆体第一轮 PCR扩增反应以提取的 DNA为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应管，第一 轮PCR反应体系的配置见附录 D.1，第一轮扩增程序见附录 D.4。 第二轮 PCR扩增反应以第一轮扩增产物为模板，第二轮 PCR反应体系的配置见附录 D.2，第二轮 扩增程序见附录 D.4。 7.2.1.3 绵羊无浆体 巢氏 PCR反应体系与扩增程序 绵羊无浆体第一轮 PCR扩增反应以提取的 DNA为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应管，第 一轮 PCR反应体系的配置见附录 D.1，第一轮扩增程序见附录 D.5。 第二轮 PCR扩增反应以第一轮扩增产物为模板，第二轮 PCR反应体系的配置见附录 D.2，第二轮 扩增程序见附录 D.5。 7.2.1.4 山羊无浆体 巢氏 PCR反应体系与扩增程序 山羊无浆体第一轮 PCR扩增反应以提取的 DNA为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应管，第 一轮 PCR反应体系的配置见附录 D.1，第一轮扩增程序见附录 D.6。 第二轮 PCR扩增反应以第一轮扩增产物为模板，第二轮 PCR反应体系的配置见附录 D.2，第二轮 扩增程序见附录 D.6。 7.3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳及成像 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 355—2026 4 使用 1× TAE缓冲溶液配制 1.0 %琼脂糖凝胶，取 5 µ L第二轮 PCR扩增产物与 1 μL 6×Loading Buffer 混匀，置于 1.0 %琼脂糖凝胶中进行电泳， 100 V电压电泳约 25 min，经凝胶成像分析系统成像 并观察结果。 8 结果判定 8.1 试验成立条件 嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、绵羊无浆体和山羊无浆体的阳性 对照样品分别扩出 641 bp、551 bp、 584 bp、594 bp大小的特异性条带，标准阴性对照无扩增条带时，判为实验有效。 8.2 阳性 8.2.1 待检样品在嗜吞噬细胞无浆体检测体系中扩增出 641bp大小的条带，可判定为嗜吞噬细胞无浆 体核酸阳性。 8.2.2 待检样品在牛无浆体检测体系中扩增出 551bp大小的条带，可判定为牛无浆体核酸阳性。 8.2.3 待检样品在绵羊无浆体检测体系中扩增出 584bp大小的条带，可判定为绵羊无浆体核酸阳性。 8.2.4 待检样品在山羊无浆体检测体系中扩增出 594bp大小的条带，可判定为山羊无浆体核酸阳性。 8.3 阴性 8.3.1 待检样品在嗜吞噬细胞无浆体检测体系中未扩增出 641bp大小的条带， 重复提取 PCR并再独立 进行 1次巢式 PCR检测后仍未出现扩增条带时，可判定为嗜吞噬细胞无浆体核酸阴性。 8.3.2 待检样品在牛无浆体检测体系中未扩增出 551bp大小的条带，