ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 352—2026 毕氏肠微孢子虫 PCR检测方法 PCR method for detection of Enterocytozoon bieneusi 2026 - 3 - 4发布 2026 - 3 - 4实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 352—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 河南农业大学 提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 河南农业大学、塔里木大学、西北农林科技大学、 信阳市畜牧兽医技术服务中心 。 本文件主要起草人： 李俊强、王荣军、张龙现、齐萌、赵光辉、胡建新、卢基忠、马超锋、赵金凤、 菅复春、张素梅、朱星宇、魏一卓、李晓迎、毋亚运、余复昌、李森阳、杜海利、许会艳 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 352—2026 1 毕氏肠微孢子虫 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了毕氏肠微孢子虫 PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。 本文件适用于动物粪便样品中毕氏肠微孢子虫核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 668 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 兽医学检测 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSL：生物安全防护实验室（ biosafety laboratory ） bp：碱基对（ base pair） ddH 2O：双蒸水（ double -distilled H 2O） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxyribonucleoside triphosphate ） ITS：内转录间隔区（ internal transcribed spacer ） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸缓冲液（ tris aectate -EDTA buffer ） rTaq酶： rTaq DNA 聚合酶（ rTaq DNA polymerase ） 5 主要仪器与设备 5.1 PCR扩增仪。 5.2 漩涡振荡器。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 352—2026 2 5.3 台式离心机。 5.4 微量可调移液器及配套吸头 （1 μL ~ 2.5 μL，0.5 μL ~ 10 μL，10 μL ~ 100 μL，100 μL ~ 1000 μL）。 5.5 核酸电泳仪。 5.6 核酸电泳槽。 5.7 凝胶成像分析系统。 5.8 高压蒸汽灭菌器。 5.9 生物安全柜或超净台 。 6 试剂与耗材 6.1 一次性密封袋。 6.2 EP离心管（1.5 mL）。 6.3 2.5 %重铬酸钾溶液，按照 附录 A中A.1规定的方法配制 。 6.4 粪便基因组 DNA提取试剂盒（市售产品，可选择同类产品替代）。 6.5 PCR管（200 μL）。 6.6 PCR扩增试剂盒（市售产品，可选择同类产品替代）。 6.7 1× TAE缓冲液，按照附录 A.2和附录 A.3规定的方法配制 。 6.8 安全无毒核酸染料。 6.9 配置试剂用水采用蒸馏水或去离子水， PCR用水按照 GB/T 6682中一级水的规定执行。 6.10 巢式 PCR引物。参照毕氏肠微孢子虫 rRNA基因 ITS位点参考序列（见附录 B），设计巢氏 PCR 扩增特异性引物序列， 见附录 C中表 C.1。 6.11 DNA标准分子质量。 6.12 1 %琼脂糖凝胶，按照附录 A.4规定的方法配制。 6.13 阳性对照： 已经鉴定的毕氏肠微孢子虫 DNA样品。 6.14 阴性对照： 灭菌双蒸水。 7 样品的采集、保存及运送 7.1 样品的采集 应按照 GB/T 27401 的相关要求进行采样。 具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作， 在 采集畜禽动物新鲜粪便样本时， 对于禽类，可 采用棉拭子从其泄殖腔取样；对于哺乳动物，可 从直肠进 行取样约10 g的新鲜粪便于一次性封口袋中。整个采样期间， 应佩戴一次性 口罩与手套，样本彼此独 立，避免交叉污染。 每份样本应标记编号、动物种类、年龄、品种、采样时间、采集地点等 信息。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 352—2026 3 7.2 样本的保存与运输 采集的新鲜粪便样品， 在2 ℃ ~ 8 ℃ 的条件下保存应不超过 24 h，长期保存需置于 2.5 %重铬酸钾溶 液中。 长距离运输的样品应先置于密封不透水、防泄漏容器内，再将容器放入具有防压、不透水及防泄漏 功能的辅助包装中，最后在周围放置医用冰袋或冷冻制剂，以确保样本维持低温状态。样本应尽快送达 检测实验室，最迟不超过 72 h。 7.3 样本处理的生物安全要求 应按照 GB 19489 的相关要求，在生物安全 2级（ BSL-2）实验室中进行检测工作，检测后的样品的 处理应按照 GB/T 27401 中有关规定进行处理。 8 操作方法 8.1 DNA制备 8.1.1 使用商品化 粪便 DNA提取试剂盒， 从 粪便样品中提取 病原 DNA， 按照试剂盒说明书进行操作， 确保提取 DNA的质量与纯度。 8.1.2 提取的 DNA样品，应立即进行 PCR扩增。若当前无法进行试验，可存放至 -20℃条件下保存。 8.2 PCR检测 8.2.1 巢氏 PCR反应体系与扩增程序 8.2.1.1 第一轮PCR反应体系与扩增程序 以提取的 DNA为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应管，反应体系 的配置见附录 D中表 D.1。 第一轮 PCR扩增反应的反应程序见附录 D.2。 8.2.1.2 第二轮PCR反应体系与扩增程序 以第一轮扩增产物为模板， 将所有试剂 、引物加入 PCR反应管，反应体系 的配置见附录 D中表 D.3。配置完反应液后应充分震荡混匀并离心之后，进行第二轮扩增。 第二轮 PCR扩增反应的反应程序见附录 D.4。 8.3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳及成像 使用1× TAE缓冲溶液配制 1.0 %琼脂糖凝胶，取 第二轮 PCR扩增产物 5 µ L ~ 10 µ L，置于 1.0 % 琼脂糖凝胶中进行电泳， 120 V电压电泳 约30 min，经凝胶成像分析系统 成像并观察结果 。 9 结果判定 9.1 试验成立条件判定 毕氏肠微孢子虫阳 性对照在392 bp处，出现相应的特异性条带，阴性对照无扩增条带 （见附录 E 中图 E.1），判定为试验成立。 9.2 结果描述及判定 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 352—2026 4 9.2.1 阳性 试验成立条件下，被检样品 在392 bp处出现特异性条带 ，判定为毕氏肠微孢子虫核酸阳性。 如果需要进一步鉴定其序列或基因型，可对 PCR扩增产物进行测序。 9.2.2 阴性 试验成立条件下，被检样品 在392 bp处无特异性 扩增条带，判定 为毕氏肠微孢子虫 核酸阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台