SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4419.9—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列 检测方法第9部分：栗子 Food allergen detection with LAMP methods for export- Part 9 :Chestnut 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4419.9—2016 前言 SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成： 第1部分：开心果； 第2部分：腰果； 第3部分：胡桃； 第4部分：榛果； 第5部分：杏仁； 第6部分：扁桃仁； 第7部分：巴西坚果； 第8部分：澳洲坚果； 第9部分：栗子； 第10部分：大豆； 第11部分：羽扇豆； 第12部分：花生； 第13部分：葵花籽； 第14部分：芝麻； 第15部分：大麦； 第16部分：小麦； 第17部分：芥麦； 第18部分：芥末； 第19部分：胡萝卜； 一第20部分：芹菜； 第21部分：牛奶； 第22部分：虾。 本部分为SN/T4419的第9部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：谢力、凌莉、陈源树、刘津、韩建勋陈颖、高东微、李志勇、刘青、席静、关丽军 1 SN/T 4419.9—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列 检测方法第9部分：栗子 1范围 SN/T4419的本部分规定了食品中过敏原栗子成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法 本部分适用于食品及其原料中过敏原板栗（Castaneamollissima）和锥栗[Castaneahenryi（Skan） Rehd.etWils.］成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检测限（LOD）为0.5%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件、 3.1.1 过敏原allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。 3.1.2 栗子chestnut 栗子，又名栗，壳斗科栗属植物可食用种类的种仁，主要包括板栗（Castaneamollissima）和锥栗 信息服 [Castaneahenryi(Skan)RehdetWils.J。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTP LAMP Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 4防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403—2008中附录D的规定。 1 SN/T 4419.9—2016 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用栗子leafy-likeproteinmRNA基因特异性检测引 物进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原栗子成分。 6LAMP检测方法 6.1原理 根据栗子leafy-likeproteinmRNA基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性 识别靶序列上的6个独立区域，在链置换型BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶 序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合 物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉 淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 显色液显色原理：SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到双链DNA 的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时， SYBRGreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA 的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜 色由橙色变为绿色。 6.2 仪器和设备 6.2.1水浴锅或加热模板：63℃±1℃和80℃±1℃。 6.2.2离心管:0.1mL、1.5mL。 6.2.3计时器。 6.2.4移液枪：量程0.5μL~10μL、量程10μL~100μL、量程100μL~1000μL。 6.3 3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或尘化试剂。 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格 6.3.2 CTAB 提取缓冲液(20 g/L CTAB,1. 4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Naz ED TA,pH 8. 0)。 6.3.4NaCl溶液:1.2mmol/L。 6.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。 6.3.6 dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L 6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。 6.3.810×ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L 氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L。 6.3.10甜菜碱：5mol/L。 6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000X。 引物：根据栗子leafy-likeproteinmRNA基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物 FIP/BIP,环引物FLP/BLP,见表1。 2