SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4419.22—2016 出口食品常见过敏原LAMIP系列检测方法 第22部分：虾 Food allergen detection with LAMP methods for export- Part 22 :Shrimp 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4419.22—2016 前言 SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成： 第1部分：开心果； 第2部分：腰果； 第3部分：胡桃； 第4部分：榛果； 第5部分：杏仁； 一第6部分：扁桃仁； 第7部分：巴西坚果； 第8部分：澳洲坚果； 第9部分：栗子； 第10部分：大豆； 第11部分：羽扇豆； 第12部分：花生； 第13部分：葵花籽； 第14部分：芝麻； 第15部分：大麦； 第16部分：小麦； 第17部分：荞麦； 第18部分：芥末； 第19部分：胡萝卜； 第20部分：芹菜； 第21部分：牛奶； 第22部分：虾。 本部分为SN/T4419的第22部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、广州迪澳生 物科技有限公司。 本部分主要起草人：徐君怡、曹际娟、陈颖、李一尘、肖姗姗、郑秋月、刘冉、张璜。 1 SN/T 4419.22—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第22部分：虾 1范围 本部分适用于食品及其原料中过敏原虾成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检测限（LOD)为0.5%（质量分数）。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 过敏原allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。 3.1.2 虾 shrimp 属节肢动物门（Arthropoda）甲壳亚门（Crustacea），种类很多，包括青虾、河虾、草虾、小龙虾、对虾、 标准信息 基围虾、琵琶虾等。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） LAMP环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification） TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚 4 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403一2008中附录D的规定 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用虾线粒体12SrRNA基因特异性检测引物进行 1 SN/T4419.22—2016 LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原虾成分。 6LAMP检测方法 6.1原理 根据虾线粒体12SrRNA基因序列设计特异性内引物、外引物（和环引物）各一对，特异性识别靶序 列上的6个或8个独立区域。在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利 用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链。由于内引物与相邻区域存在互补区，游离的 内引物合成链折叠成茎-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结构 DNA。加入显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果。DNA聚合反应析出的焦磷酸根离子 与溶液中的Mg2+结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果 显色液显色原理：SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染 料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此， SYBRGreenI荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系中 的dsDNA的量。 6.2仪器和设备 6.2.1水浴锅或加热模板：65℃±1℃和80℃土1℃。 6.2.2离心管：0.1mL、1.5mL。 6.2.3计时器。 6.2.4移液枪：量程0.5μL~10μL、量程10μL~100μL、量程100μL~1000μL 6.3试剂和材料 6.3.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格， 6.3.2 CTAB 提取缓冲液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2 EDTA, pH 8.0)。 6.3.3CTAB沉淀液(5g/L CIAB,40 mmol/L NaCI)。 6.3.4NaCl溶液:1.2mmol/L。 6.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。 6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。 6.3.810×ThermolPol 缓冲液:含 200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L。 6.3.10甜菜碱：5mol/L。 6.3.11显色液:SYBRGreenI荧光染料，1000X。 6.3.12引物：根据虾线粒体12SrRNA基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/ BIP,见表1。 2