SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4419.21—2016 出口食品常见过敏原LAMIP系列检测方法 第21部分：牛奶 Food allergen detection with LAMP methods for export- Part 21: Milk 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4419.21—2016 前言 SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成： 第1部分：开心果； 第2部分：腰果； 第3部分：胡桃； 一第4部分：榛果； 第5部分：杏仁； 第6部分：扁桃仁； 第7部分：巴西坚果； 第8部分：澳洲坚果； 第9部分：栗子； 第10部分：大豆； 第11部分：羽扇豆； 第12部分：花生； 第13部分：葵花籽； 第14部分：芝麻； 第15部分：大麦； 第16部分：小麦； 第17部分：养麦； 第18部分：芥末； 第19部分：胡萝卜； 第20部分：芹菜； 第21部分：牛奶； 第22部分：虾。 本部分为SN/T4419的第21部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：曾静、张西萌、魏海燕、付溥博、陈颖、马丹、刘莉、赵晓娟。 义务平台 1 SN/T 4419.21—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第21部分：牛奶 1范围 SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原牛奶成分的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。 本部分适用于食品及其原料中过敏原牛奶成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检测限（LOD)为0.5%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 过敏原allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原 3.1.2 牛奶 3milk -种白色的液体，由哺乳动物的乳腺分泌而来，是初生哺乳动物的主要食物来源，其中β-乳球蛋白 是牛奶致敏的主要成分。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) LAMP环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification） TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚 4 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403一2008中附录D的规定 5方法提要 样品经浓缩后，提取DNA，以DNA为模板，采用牛线粒体细胞色素b（cyt-b）基因特异性检测引物 1 SN/T 4419.21—2016 进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原牛奶成分。 6LAMP检测方法 6.1原理 根据牛线粒体细胞色素b基因序列设计特异性内引物、外引物各一对以及一条环引物，特异性识别 靶序列上的7个独立区域，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，在线粒体特异靶序列启动互补 链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析 出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀， 加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBRGreenI是一种结合于所 有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧 光，但一旦与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreen的荧光信号强度与dsDNA的数量相 关，可以根据荧光信号检测出LAMP反应体系存在的dsDNA数量。 6.2 仪器和设备 6.2.2离心管:0.1 mL、1.5mL。 6.2.3计时器。 6.2.4移液枪：量程0.5μL~10μL、量程10μL100μL、量程100μL~1000uL。 6.3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.3.2 CTAB 提取缓冲液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02mol/L NazEDTA, pH 8.0)。 准信息服务 6.3.3 CTAB沉淀液(5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCI) 6.3.4NaCl溶液:1.2mmol/L。 6.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。 6.3.6dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。 6.3.810×ThermolPol缓冲液：含200 mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L。 6.3.10甜菜碱：5mol/L 6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000X。 6.3.12引物：根据牛奶线粒体细胞色素b基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP BIP,环引物BLP,见表1。 2