SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4419.2—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列 检测方法第2部分：腰果 Food allergen detection with LAMP methods for export- Part 2 :Cashew 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4419.2—2016 前言 SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成： 第1部分：开心果； 第2部分：腰果； 第3部分：胡桃； 第4部分：榛果； 第5部分：杏仁； 第6部分：扁桃仁； 第7部分：巴西坚果； 第8部分：澳洲坚果； 第9部分：栗子； 第10部分：大豆； 第11部分：羽扇豆； 第12部分：花生； 第13部分：葵花籽； 第14部分：芝麻； 第15部分：大麦； 第16部分：小麦； 第17部分：荞麦； 第18部分：芥末； 第19部分：胡萝卜； 一第20部分：芹菜； 第21部分：牛奶； 第22部分：虾。 本部分为SN/T4419的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共 和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验 检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈颖、黄文胜、曹际娟、曾静、韩建勋、刘伟、高宏伟、高东微、邓婷婷、张舒亚、 吴亚君。 1 SN/T 4419.2—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列 检测方法第2部分：腰果 1范围 SN/T4419的本部分规定了食品中过敏原腰果成分的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。 本部分适用于食品及其原料中过敏原腰果成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检测限（LOD）为0.5%（质量分数）。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1961.4—2013 出口食品过敏原成分检测第4部分：实时荧光PCR方法检测腰果成分 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 过敏原 allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。 3.1.2 腰果 cashew 别名：鸡腰果、介寿果、如树漆树科腰果属腰果（AnacardiumoccidentaleL.）树所产坚果。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTP 脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） LAMP 环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification） TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚 4 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403一2008中附录D的规定。 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用腰果2S球蛋白基因特异性检测引物进行LAMP 1 SN/T4419.2—2016 扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原腰果成分。 6LAMP检测方法 6.1原理 根据腰果2S种子贮存蛋白基因序列设计特异性内引物、外引物（和环引物）各一对，特异性识别靶 序列上的6个或8个独立区域。在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并 利用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链。由于内引物与相邻区域存在互补区，游离 的内引物合成链折叠成茎-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结 构DNA。加入显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果。DNA聚合反应析出的焦磷酸根离 子与溶液中的Mg?+结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果。 显色液显色原理：SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染 料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此， SYBRGreenI荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系 中的dsDNA的量。 6.2仪器和设备 6.2.1水浴锅或加热模板：65℃±1℃和80℃±1℃。 6.2.2离心管：0.1mL、1.5mL。 6.2.3计时器。 6.2.4移液枪：量程0.5μL~10μl、量程10uL~100μL、量程100μL~1000μL。 6.3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1 CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/L NazEDTA,pH8.0。 6.3.2CTAB沉淀液:5g/LCTAB,40mmol/LNaCl 6.3.3NaCl溶液:1.2mmol/L。 6.3.4蛋白酶K:20mg/mL。 6.3.5 6.3.6BstDNA聚合酶：酶浓度8U/uL。 6.3.710×ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8）,100mmol/L硫酸铵、100mmol/L 服务、 氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.8硫酸镁溶液：50mmol/L。 6.3.9甜菜碱：5mol/L。 6.3.10显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000×。 6.3.11引物：根据腰果2S球蛋白基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/BIP,环引 物FLP/BLP，见表1。 2