SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4419.13—2016 出口食品常见过敏原LAMIP系列检测方法 第13部分：葵花籽 Food allergen detection with LAMP methods for export- Part 13:Sunflower seed 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4419.13—2016 前言 SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成： 第1部分：开心果； 第2部分：腰果； 第3部分：胡桃； 第4部分：榛果； 第5部分：杏仁； 第6部分：扁桃仁； 第7部分：巴西坚果； 第8部分：澳洲坚果； 第9部分：栗子； 第10部分：大豆； 第11部分：羽扇豆； 第12部分：花生； 第13部分：葵花籽； 第14部分：芝麻； 第15部分：大麦； 第16部分：小麦； 第17部分：荞麦； 第18部分：芥末； 第19部分：胡萝卜； 一第20部分：芹菜； 第21部分·牛奶； 第22部分：虾。 本部分为SN/T4419的第13部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：凌莉、张隽、刘津、李婷、邓婷婷、陈颖、高东微、刘青、席静、关丽军、李志勇。 务平台 1 SN/T 4419.13—2016 出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第13部分：葵花籽 1范围 SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原葵花籽成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法。 本部分适用于食品及其原料中过敏原葵花籽成分的定性检测。 本部分所规定方法的最低检测限（LOD）为0.5%（质量分数）。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 过敏原 allergen 又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。 3.1.2 葵花籽 sunflower seed 葵花籽又名葵瓜子、葵子，是菊科向日葵属草本植物向日葵Helianthusannuus的种子。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸 (deoxyribonucleosidetriphosphate) LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermalamplification） TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚 4 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403一2008中附录D的规定。 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用葵花籽HaG5基因特异性检测引物进行LAMP扩 1 SN/T 4419.13—2016 增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原葵花籽成分。 6LAMP检测方法 6.1原理 根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的 6个独立区域，在链置换型BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶序列启动互补链 合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出 的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即 可通过颜色变化观察判定结果。 显色液显色原理：SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到dsDNA的 小沟内。当它与dsDNA结合时，荧光信号是游离状态的800一1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR GreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着dsDNA的增加， SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表dsDNA分子的数量，同时颜色由橙色变 为绿色。 6.2仪器和设备 6.2.1水浴锅或加热模板：63℃±1℃和80℃±1℃。 6.2.2离心管:0.1mL、1.5mL。 6.2.3计时器。 6.2.4移液枪：量程0.5μL~10μl、量程10uL~100μL、量程100μL~1000μL。 6.3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格 6.3.2 Na2EDTA,pH 8.0)。 6.3.3 CTAB沉淀液(5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCI)。 6.3.4NaCl溶液:1.2mmol/L。 6.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。 6.3.6dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10 mmol/L。 6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度8U/uL。 6.3.810×ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)100mmol/L硫酸铵、100mmol/L 氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L。 6.3.10甜菜碱：5mol/L。 6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000X。 6.3.12引物：根据葵花籽HaG5基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/BIP，环引 物FLP/BLP，见表1。 2